Giardia duodenum är en parasitisk organism som orsakar giardiasis, en tarminfektion särskilt vanlig hos små barn med kliniska tecken på diarré.Vi har tidigare rapporterat att extracellulär G. duodenalis utlöser aktiveringen av intracellulär oligomeriseringsliknande receptor 3 (NLRP3) bindande nukleotider och reglerar värdinflammatoriska svar genom extracellulär vesikel (EV) sekretion.De exakta molekylära mönstren för den patogenassocierade duodenokocken EV (GEV) som är involverad i denna process och rollen för NLRP3-inflammasomen i giardiasis återstår dock att klarläggas.
Rekombinanta eukaryota expressionsplasmider pcDNA3.1(+)-alfa-2 och alfa-7.3 giardiner i GEV konstruerades, transfekterades in i primära peritoneala musmakrofager och detekterades genom att mäta inflammationsmålmolekylen caspase-1.p20-expressionsnivån screenades..G. duodenalis alfa-2 och alfa-7.3 giardiner identifierades ursprungligen genom att mäta NLRP3-inflammasom (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 och caspase-1 p20), IL-sekretion.1β-nivåer, apoptotic spotted protein (ASC) oligomeriseringsnivåer och immunofluorescerande lokalisering av NLRP3 och ASC.NLRP3-inflammasomens roll i patogeniciteten av G. duodenalis utvärderades sedan med hjälp av möss där NLRP3-aktivering blockerades (NLRP3-blockerade möss) och patologiska förändringar i kroppsvikt, duodenal parasitisk belastning och duodenal vävnad övervakades.Dessutom undersökte vi huruvida hiardiner alfa-2 och alfa-7.3 inducerar IL-1β-sekretion in vivo via NLRP3-inflammasomen och bestämde rollen för dessa molekyler i patogeniciteten av G. duodenalis hos möss.
Alfa-2- och alfa-7.3-giardiner inducerar aktiveringen av NLRP3-inflammasomen in vitro.Detta ledde till aktiveringen av p20-kaspas-1, en ökning av uttrycksnivåerna av NLRP3-, pro-IL-1β- och pro-kaspas-1-proteiner, en signifikant ökning av IL-1β-utsöndringen, bildandet av ASA-fläckar i cytoplasma och induktionen av ASA-oligomerisering.NLRP3-inflammation Penisförlust förvärrar patogeniciteten hos G. duodenalis hos möss.Möss behandlade med cystor genom sondmatning från NLRP3-blockerade möss uppvisade ett ökat antal trofozoiter och allvarlig skada på duodenal villi, kännetecknad av nekrotiska krypter med krympta och förgrenade.In vivo-experiment har visat att giardiner alfa-2 och alfa-7.3 kan inducera utsöndring av IL-1β via NLRP3-inflammasomen, och immunisering med giardiner alfa-2 och alfa-7.3 minskade patogeniciteten av G. duodenalis hos möss.
Sammantaget tyder resultaten av denna studie på att giardia alfa-2 och alfa-7.3 orsakar uppreglering av värd NLRP3-inflammation och minskar smittsamheten hos G. duodenalis hos möss, som är lovande mål för att förhindra giardiasis.
Giardia duodenum är en extracellulär protozoparasit som lever i tunntarmen och orsakar 280 miljoner fall av giardiasis med diarré årligen, särskilt bland små barn i utvecklingsländer [1].Människor blir smittade av dricksvatten eller mat som är förorenad med M. duodenum-cystor, som sedan kommer in i magsäcken och utsöndras i magsaften.Giardia duodenum trofozoiter fäster vid tolvfingertarmens epitel, vilket orsakar illamående, kräkningar, diarré, buksmärtor och viktminskning.Individer med immunbrist och cystisk fibros är mottagliga för infektion.Infektion kan även ske genom oral- och analsex [2].Läkemedel som metronidazol, tinidazol och nitazoxanid är de föredragna behandlingsalternativen för duodenala infektioner [3].Dessa kemoterapiläkemedel orsakar dock negativa biverkningar som illamående, karcinogenes och genotoxicitet [4].Därför behöver mer effektiva strategier utvecklas för att förhindra G. duodenalis-infektion.
Inflammasomer är en klass av cytosoliska proteinkomplex som är en del av det medfödda immunsvaret, som hjälper till att försvara mot patogeninvasion och medierar inflammatoriska svar [5].Bland dessa inflammasomer har nukleotidbindande oligomerisering (NOD) receptor 3 (NLRP3) nukleotidbindande oligomerisering (NLRP3) nukleotidbindande-liknande inflammasom studerats omfattande eftersom den kan detekteras av olika patogen/skada-associerade molekylära mönster (PAMP/ DAMP), känner igen, aktiverar det medfödda immunförsvaret.och reglerar intestinal homeostas vid många inflammatoriska sjukdomar [6,7,8].Den består av mönsterigenkänningsreceptorn (PRR) NLRP3, ett adapter apoptotiskt fläckigt protein (ASC) och en effektor procaspase-1 eller procaspase-11.NLRP3-inflammasomen fungerar som en värd mot patogeninvasion, som observerats i Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] och Leishmania-studier.[11], men det har också rapporterats att aktivering av NLRP3-inflammasomen begränsar skyddande immunsvar och förvärrar sjukdomsprogression, till exempel hos maskar [12].Baserat på våra tidigare fynd rapporterade vi att extracellulär G. duodenalis utlöser intracellulär aktivering av NLRP3-inflammation och modulerar värdinflammatoriska svar genom att utsöndra extracellulära vesiklar (EV) [13].Rollen för NLRP3-inflammasomen i G. duodenalis-infektion in vivo återstår dock att fastställa.
Giardiner beskrevs ursprungligen som strukturella komponenter i G. duodenalis cytoskelettet och spelar en viktig roll för trofozoiters motilitet och epitelcellsfästning i tunntarmen.För att bättre anpassa sig till miljön och öka deras patogenicitet utvecklade G. duodenalis trophozoites en unik cytoskelettstruktur bestående av 8 flageller, 1 mellankropp och 1 ventral disk [14].Trofozoiterna i Giardia duodenum använder sitt cytoskelett för att penetrera den övre tunntarmen, särskilt tolvfingertarmen, och fästa till enterocyter.De migrerar ständigt och fäster till epitelceller med hjälp av cellmetabolism.Därför finns det ett nära samband mellan deras cytoskelett och virulens.Giardiner specifika för Giardia duodenum är komponenter i cytoskelettstrukturen [15] och är indelade i fyra klasser: α-, β-, γ- och δ-giardiner.Det finns 21 medlemmar av α-giardin-familjen, som alla har en kalciumberoende förmåga att binda fosfolipider [16].De kopplar också cytoskelettet till cellmembranet.Hos individer med diarré orsakad av G. duodenalis är α-giardiner starkt uttryckta och immunreaktiva under infektion [17].Heterologa vacciner baserade på Giardia alfa-1 skyddade mot giardiasis hos möss och är potentiella kandidatantigener för vaccinutveckling [18].Alfa-8-giardin, lokaliserat i plasmamembranet och flagellerna, men inte i ventralskivan, ökar motiliteten och tillväxthastigheten för trofozoiter i G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin fäster på mikrotubulistrukturer på flageller och påverkar livsdugligheten hos G. duodenalis [20].Alfa-11-giardin finns i överflöd under hela livscykeln, och överuttryck av alfa-11-giardin skadar själva G. duodenalis [21].Det är dock oklart om alfa-2-giardin och alfa-7.3-giardin är skyddande mot G. duodenalis-infektion och deras underliggande mekanismer.
I denna studie transfekterades rekombinanta eukaryota expressionsplasmider pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardine och pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardin in i primära peritoneala makrofager från mus för att aktivera värd NLRP3.Inflammasoma mål screenades sedan.Vi utvärderade också NLRP3-inflammasomens roll i patogeniciteten av G. duodenalis, undersökte om alfa-2 och alfa-7,3-giardiner inducerar aktivering av NLRP3-inflammasomen in vivo och fastställde att dessa två roller för giardiner i patogeniciteten av G. duodenalis.Vårt gemensamma mål var att utveckla lovande mål för att förebygga G. duodenalis-infektion.
Vildtyp (WT) C57BL/6 honmöss i åldern 5–8 veckor köptes från Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Kina).Möss hade fri tillgång till vatten, fick steriliserad mat och hölls i en 12/12 timmars ljus/mörker-cykel.Före infektion fick möss antibiotika ad libitum i dricksvatten kompletterat med ampicillin (1 mg/ml), vankomycin (1 mg/ml) och neomycin (1,4 mg/ml) (alla köpta från Shanghai, Kina, konstgjorda organismer) [22 ].].Möss som förlorade förmågan att äta och dricka i > 24 timmar och förlorade ≥ 20 % kroppsvikt avlivades humant genom cervikal dislokation.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) kompletterades med 12,5 % fetalt bovint serum (FBS; Every Green, Zhejiang, Kina) och 0,1 % bovin galla (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) ).USA) under mikroaeroba förhållanden.Sammanflytande trofozoiter uppsamlades på is och passerade i ett förhållande av 1:4 för ytterligare reproduktion.
Giardia duodenumcystor inducerades som beskrivits tidigare [23], trofozoiter skördades i logaritmisk fas och späddes sedan ut med inkapslingsinducerande medium, pH 7,1 (modifierad TYI-S-33) till en slutlig koncentration av 1 × 106 trofozoiter/ml.gallkoncentration 0,05% medium).Trofozoiter odlades under anaeroba betingelser vid 37°C fram till den logaritmiska tillväxtfasen.Byt mediet till cystanducerande medium (pH 7,8; ​​modifierat TYI-S-33-medium med 1 % gallkoncentration) och odla G. duodenalis vid 37°C under 48–96 timmar, under vilken bildningscystor observerades under ett mikroskop.Efter att de flesta av trofozoiterna hade inducerats att bilda cystor, skördades odlingsblandningen och återsuspenderades i sterilt avjoniserat vatten för att lysera de återstående trofozoiterna.Cystor räknades och lagrades vid 4°C för efterföljande analyser genom en magsond hos möss.
Giardia extracellulära vesiklar (GEV) berikades som beskrivits tidigare [13].Trofozoiter i logaritmisk tillväxtfas återsuspenderades i modifierat TYI-S-33-medium framställt med exosomutarmat FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) till en slutlig koncentration av 1 × 106 parasiter/ml och inkuberades i 12 timmar.isolerades från odlingssupernatanten genom centrifugering vid 2000 g under 10 min, 10 000 g under 45 min och 100 000 g under 60 min.Fällningarna löstes i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), kvantifierades med användning av ett BCA-proteinanalyskit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) och lagrades vid -80°C eller användes direkt för ytterligare analyser.
Primära mus peritoneala makrofager framställdes som beskrivits tidigare [24].Kortfattat injicerades möss (i åldern 6-8 veckor) (intraperitonealt [ip]) med 2,5 ml 2,98 % Difco flytande tioglykolmedium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) och matades med 3-4 gommar.En suspension av makrofager uppsamlades från bukhålan hos möss efter dödshjälp och centrifugerades 3 gånger vid 1000 g under 10 minuter.Skördade celler detekterades med flödescytometri med användning av CD11b-markören tills cellrenheten var >98 %, sattes sedan till 6-brunnars cellodlingsplattor (4,5 x 106 celler/brunn) och inkuberades med 10 % FBS (Bioindustri) vid 37°C.och 5 % CO2.
RNA extraherades från 1 × 107 trofozoiter i 1 ml TRIzol-reagens (Vazyme, Nanjing, Kina), genomiskt DNA extraherades från totalt G. duodenalis RNA med användning av MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Kina) och komplementärt DNA (cDNA) syntetiserades använda MonScript RTIIII Super Mix (Monad) enligt tillverkarens instruktioner.
CDS-sekvensinformation för mål-G. duodenalis-genen erhölls från NCBI GenBank.Använd Primer 5.0 för att designa specifika sömlösa kloningsprimrar för varje målgen.Den framåtriktade primern (5′-3′) består av tre delar: en överlappande sekvens med en linjäriserad vektor pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) och startkodonen ATG och GNN (om den första basen inte är G).Detta görs för att förbättra uttryckets effektivitet.Dessutom minst 16 bp kombinerade baser (GC-halt 40–60%/Tm ca 55 °C).Den omvända primern (5′-3′) består av två delar, en överlappande sekvens med en EcoRV-linjäriserad vektor pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) och en kombinerad bas på minst 16 bp.(exklusive de två sista stoppen).baser) ett kodon såsom AA eller GA för att tillåta rekombinanta plasmider att uttrycka sina märkta proteiner).Primersekvenserna är listade i tabell 1 och syntetiserades av Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Kina).
Mål amplifierades med användning av Pfu DNA-polymeras (Tiangen, Peking, Kina) eller Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, Kina) med användning av preparerat G. duodenalis cDNA som en mall.Den eukaryota expressionsvektorplasmiden pcDNA3.1(+) linjäriserades med restriktionsenzym EcoRV och defosforylerades med användning av Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linjäriserade pcDNA3.1(+)-fragment och amplifierade målgenfragment renades med användning av ett DNA-gelreningskit (Tiangen) och kvantifierades med användning av en Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).pcDNA3.1(+)-fragmentet och varje målgenfragment rekombinerades med användning av MonClone-kloningsblandning för en enda samling (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Kina) och bekräftades genom DNA-sekvensering med användning av Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Kina)..
Endotoxinfria plasmider pcDNA3.1(+)-alfa-2 och pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 genererades med användning av SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Koncentrationen hölls över 500 ng/ul för att säkerställa att EDTA i elueringsbufferten inte störde transfektionsanalysen.Primära peritoneala musmakrofager odlades i 6-brunnars plattor med komplett RPMI 1640-medium (Biological Industries) i 12 timmar, sedan tvättades cellerna 3 gånger i varm PBS för att avlägsna penicillin och streptomycin och sedan i medium kompletterat med komplett medium.Endotoxinfria plasmider pcDNA3.1(+)-alfa-2 och pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2,5 μg) späddes i 125 μl Opti-MEM reducerat serummedium (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Därefter späddes 5 µl Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) i 125 µl Opti-MEM-medium med låg serumhalt.Förbered liposom-DNA-komplex genom att blanda den utspädda endotoxinfria plasmiden med Lipofectamine 2000 och låt blandningen stå i rumstemperatur i 5 minuter.Överför komplexen separat till celler i varje brunn och blanda långsamt.Efter 4 timmar ersattes cellodlingsmediet med 2 ml komplett RPMI 1640-medium och odlingen fortsatte under 24 timmar.Färskt cellodlingsmedium tillsattes till cellerna och inkuberades under olika tidpunkter beroende på analysdesignen.
Proteinprover från supernatanter och cellysat framställdes som beskrivits tidigare [25].Membranöverföringsparametrar för pro-IL-1β, pro-kaspas-1, kaspas-1 p20, NLRP3, β-aktin och His-tag var 200 mA/90 min.För interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Schweiz) och NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Schweiz) och 1:5000 inriktad på His tag ( Amylet Scientific, Wuhan, Kina) och β-aktin (Proteintech, Wuhan, Kina).
Tvärbindning med disuccinimidsuberat (DSS) utfördes som beskrivits tidigare [26].Cellerna tvättades 3 gånger med kall PBS och lyserades fullständigt med en 27 gauge nål i 50 ul ASC-reaktionsbuffert (pH 8,0) innehållande 25 mM Na2P04, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES och 125 mM NaHC03.Blandningen centrifugerades vid 5000 g under 3 minuter och pelleten suturerades med 10 pl DSS (25 mM i DMSO) och 40 pl ASC-reaktionsbuffert under 30 minuter vid 37°C.Efter centrifugering vid 5000 g under 10 minuter löstes pelleten i en lösning av 40 µl ASC-reaktionsbuffert och 10 µl 6x proteinladdningsbuffert (TransGen, Beijing, Kina), och sedan släcktes lösningen vid rumstemperatur i 15 min., Koka sedan i 10 minuter.Proteinprover utsattes sedan för Western blotting med användning av primära anti-ASC-antikroppar (Wanleibio, Shenyang, Kina) vid ett utspädningsförhållande på 1:500.
Efter en tidigare beskriven procedur [13] skördades cellkultursupernatanter och utsöndring av den pro-inflammatoriska cytokinen IL-1β bestämdes med användning av mus IL-1 Beta ELISA kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Konvertera OD450nm-värden till proteinkoncentrationer med hjälp av IL-1β-standardkurvan.
Celler belagda på täckglas tvättades försiktigt 3 gånger i varm PBS, fixerades i vävnadscellfixativ (Biosharp, Beijing, Kina) i 10 minuter vid rumstemperatur (RT), i 0,1 % Triton X-Permeabilize vid 100 (utspädd i PBS; Biosharp 20 minuter vid rumstemperatur och blockera i 5 % bovint serumalbumin (i PBS) under 2 timmar vid rumstemperatur.Celler inkuberades sedan över natten vid 4°C med primära antikroppar mot ASC (1:100 spädning) respektive NLRP3 (1:100 spädning), respektive Cy3-märkt get-anti-kanin IgG(H+L) (1:400; EarthOx) , San Francisco, CA, USA) eller FITC-konjugerad get-anti-mus IgG (1:400; Earthox) över natten vid 37°C i mörker under 1 timme.Kärnorna färgades med Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Kina) i 5 minuter och observerades under ett fluorescensmikroskop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
Möss delades in i fyra grupper (n = 7 i varje grupp): (i) PBS-behandlad negativ kontrollgrupp (endast PBS; sondmatning 100 µl/mus PBS följt av daglig intraperitoneal injektion 100 µl/mus PBS 3 timmar senare)., kontinuerligt i 7 dagar);(ii) negativ kontrollgrupp behandlad med MCC950-hämmare [27] (100 µl/mus via PBS sondmatning, 3 timmar senare, 10 mg/kg kroppsvikt [BW] MCC950 [i PBS] administrerades intraperitonealt dagligen, varaktighet 7 dagar);(iii) G. duodenalis cystinfektionsgrupp (1,5 x 106 cystor/mus genom sondmatning, 3 timmar senare, 100 μl/mus PBS intraperitonealt administrerat dagligen i 7 dagar);(iv) G. duodenalis cysta kombinerad infektionsgrupp MCC950-hämmare behandlingsgrupp (1,5×106 cystor/mus via sondmatning, 10 mg/kg kroppsvikt MCC950 intraperitonealt dagligen i 7 dagar vid 3 timmar).Kroppsvikten för varje mus övervakades dagligen och alla möss avlivades på den 7:e dagen.Skördad duodenum (3 cm lång) skars i små bitar i 1 ml PBS, cystor förstördes över natten i PBS vid 4°C och G. duodenalis trophozoites.Färsk duodenum (1 cm lång) isolerades för hematoxylin- och eosin- (H&E)-färgning.
Möss delades in i två grupper: (i) MOCK-kontrollgrupp och (ii) MCC950-inhibitorgrupp.Det fanns fem behandlingar i varje grupp (n = 7/behandlingsgrupp): (i) PBS-behandling negativ kontrollgrupp (endast PBS; 100 µl/mus PBS, intramuskulär (IM) injektion (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plasmidnegativ kontrollgrupp (100 µg/mus-DNA, via intramuskulär injektion) (iii) G. duodenalis cystinfektion positiv kontrollgrupp (1,5 x 106 cystor/mus, via sondmatning) (iv) a); grupp behandlad med plasmid pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/mus-DNA, genom intramuskulär injektion), och (v) en grupp behandlad med plasmid pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/mus) DNA, efter 12 timmars passage, fick möss i MCC950-hämmargruppen en daglig intraperitoneal injektion av MCC950 (10 mg/kg kroppsvikt) under 7 dagar, medan möss i MOCK-gruppen fick en lika stor volym PBS-behandling. Blodprover var uppsamlade från ögonglobsmössen och lämnade över natten vid 4 °C. Serumprover isolerades med användning av enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) för och mätningar av IL-1β-nivåer.
Trettiofem möss delades in i fem grupper (n=7/grupp).Grupp 1 var en negativ kontrollgrupp som behandlades med PBS: möss fick 100 μl PBS intramuskulärt och 3 dagar senare genom sondmatning.Grupp 2 är en positiv kontrollgrupp infekterad med G. duodenalis-cystor: möss injicerades med 100 μl PBS, och 3 dagar senare injicerades 1,5 x 106 cystor/mus intragastriskt.Tredje gruppen – plasmidimmunisering med pcDNA3.1(+) i kombination med en kontrollgrupp för duodenal cystainfektion: möss fick 100 μg plasmid-DNA pcDNA3.1(+)(im) oralt, 1,5×106 cystor/mus 3 för flera dagar.Grupperna 4 och 5 var rekombinant pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardinplasmid eller pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardinplasmid i kombination med G. duodenalis-cystinfektion.Experimentell grupp: möss fick 100 µg pcDNA3.1(+)-giardinplasmid-DNA (im), sedan 3 dagar senare injicerades 1,5 x 106 cystor/mus via sondmatning.Kroppsvikten för varje mus övervakades efter införandet av G. duodenalis-cystan genom röret.Färsk duodenum samlades in för parasitiska belastningsmätningar och HE-färgningsanalys.
Histopatologiska förändringar analyserades enligt en tidigare publicerad procedur [30].Färsk duodenum fixerades med vävnadscellfixativ, inbäddad i paraffin, skars i 4 μm sektioner, färgades med H&E och analyserades under ett ljusmikroskop.Representativa patologiska förändringar i sju vävnadssnitt från sju oberoende möss utvärderades av en patolog som inte var medveten om behandlingen och fångades med 200x förstoring.Villiernas längd och krypternas djup mättes i enlighet med de tidigare beskrivna metoderna.
Resultaten in vitro och in vivo erhölls i tre exemplar.Grafer genererades med användning av GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Skillnader mellan två grupper analyserades med t-test, medan skillnader mellan ≥3 grupper analyserades genom envägsvariansanalys (ANOVA) med SPSS-programvara (version 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Data analyserades med avseende på varianshomogenitet med Levenes test följt av Bonferronis post hoc test (B).Signifikans uttrycks som P<0,05, P<0,01 och P<0,001 (ej signifikant [ns]) (P>0,05).
Vår tidigare analys av GEV-proteomik i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) visade att många mål kan vara involverade i aktiveringen av inflammatoriska signalvägar [13].Vi valde ut två lovande mål, alfa-2 och alfa-7.3 giardiner, amplifierar dessa molekyler och använder dem för att konstruera den eukaryota expressionsvektorn pcDNA3.1(+).Efter sekvensering transfekterades rekombinanta pcDNA3.1(+)-alfa-2 och alfa-7.3 giardine-expressionsplasmider in i primära mus peritoneala makrofager, och kaspas-1 p20-signaturproteinet för inflammation (ett fragment av aktiverat kaspas-1) identifierades som att belysa nyckelmolekyler som kan utlösa inflammation.Resultaten visade att alfa-2 och alfa-7.3 giardiner kan inducera p20 kaspas-1 uttryck liknande GEV.Ingen effekt på kaspas-1-aktivering hittades i den obehandlade negativa kontrollen (endast PBS) och plasmidkontrollen pcDNA3.1(+) (Figur 1).
Mätning av aktivering av p20 kaspas-1 med pcDNA3.1(+)-alfa-2 och alfa-7.3 giardiner.Rekombinanta eukaryota expressionsplasmider pcDNA3.1(+)-alfa-2 och alfa-7.3 giardiner (ovanför varje bana) transfekterades in i primära musperitoneala makrofager och odlingssupernatanter skördades 24 timmar senare.Western blotting användes för att mäta expressionsnivåer av signatur caspase-1 p20 inflammasomproteinet.Den enda PBS-behandlingsgruppen (bana C) och pcDNA3.1(+) monoterapigruppen (pcDNA3.1-banan) användes som en negativ kontroll och GEV-behandlingsgruppen användes som en positiv kontroll.Expression av det rekombinanta proteinet bekräftades genom att detektera en histidintagg i varje protein, och de förväntade proteinbanden var alfa-2-giardin (38,2 kDa) och alfa-7,3-giardin (37,2 kDa).GEV, Giardia duodenum extracellulära vesiklar, pcDNA3.1(+), EcoRV-linjäriserad vektor, SUP, supernatant
För att bestämma huruvida alfa-2-giardin och alfa-7.3-giardin inducerar p20-kaspas-1-uttryck och spelar en roll för att aktivera värd-NLRP3-inflammatorisk respons, pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin och pcDNA3.1(+)-alfa -7,3 giardin transfekterades in i primära mus peritoneala makrofager med rekombinant plasmid-DNA, och nivåer av uttryck, lokalisering och oligomerisering av de inflammatoriska nyckelproteinerna NLRP3 bestämdes.I detta experiment användes GEV som positiv kontrollgrupp, och gruppen utan behandling (endast PBS) eller pcDNA3.1(+)-transfektionsbehandlingsgruppen var den negativa gruppen.Resultaten visade att, liksom i GEV-gruppen, resulterade rekombinant plasmid-DNA av giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 och giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 i uppreglering av NLRP3, pro-IL-1β och procaspas-1- och caspas-1-aktivering (Fig. 2a).Dessutom inducerade båda giardinerna signifikant IL-1β-sekretion (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2-giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Figur 2b).De flesta ASC-proteiner var monomera i gruppen utan behandling eller i behandlingsgruppen transfekterade med pcDNA3.1(+)-plasmiden, i motsats till pcDNA3.1(+)-alfa-2 eller pcDNA3.1(+)-alfa- 7,3 giardine.ASC-oligomerisering inträffade i det rekombinanta plasmid-DNA:t från den GEV-positiva kontrollgruppen eller gruppen, som visade en oligomer form (Figur 2c).Dessa preliminära data tyder på att alfa-2-giardin och alfa-7,3-giardin kan inducera NLRP3-inflammationsaktivering.Efterföljande immunofluorescerande studier av lokaliseringen av ASC och NLRP3 visade att i den negativa kontrollgruppen var ASC-proteinet spritt i cytoplasman och uppträdde som en punktsignal vid stimulering av pcDNA3.1(+)-alfa-2 med giardin eller pcDNA3.1(+)-alfa-7,3-giardingrupp eller GEV-positiv kontrollgrupp (Figur 2d).I den negativa kontrollen och plasmidbehandlade pcDNA 3.1-grupperna detekterades inte NLRP3-proteinsignalen, medan en fluorescerande signalpunkt som svar på pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin eller pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 upptäcktes..giardin finns i cytoplasman eller vid stimulering av HEV (Fig. 2e).Dessa data visar vidare att G. duodenalis giardin alfa-2 och giardin alfa-7.3 aktiverar NLRP3-inflammasomen i primära peritoneala makrofager hos mus.
pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin och pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardin aktiverar NLRP3-inflammasomen i peritoneala musmakrofager.Transfektera de rekombinanta eukaryota expressionsplasmiderna pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin och pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardin till primära murina peritoneala makrofager och celler, eller skörda supernatanten inom 24 timmar för analys av expression, oligomerisering , utsöndring.och lokalisering av viktiga inflammatoriska proteiner.Gruppen med endast PBS (C) och enkelbehandlingsgruppen pcDNA3.1(+) användes som negativ kontroll och GEV-behandlingsgruppen användes som positiv grupp.a Nyckelinflammatoriska proteiner NLRP3, inklusive NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspas-1 och p20-kaspas-1, detekterades genom Western blotting.b Nivåerna av utsöndring av IL-1β i supernatanterna bestämdes med användning av enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA).Skillnader mellan kontroll- och experimentgrupper analyserades genom envägsvariansanalys (ANOVA) med SPSS-programversion 22.0.Asterisker indikerar signifikanta skillnader mellan grupperna **P<0,01 och ***P<0,001.c ASC-oligomeriseringsnivåer i pellets bestämdes genom DSS-tvärbindningsanalys, medan ASC-nivåer i cellysat användes som laddningskontroll.d Visualisering av ISC-lokalisering med hjälp av immunfluorescens.e Immunofluorescens användes för att visualisera lokaliseringen av NLRP3.ASC, apoptotiskt fläckliknande protein;IL, interleukin;NLRP3, nukleotidbindande oligomeriseringsliknande receptor 3;ns, inte signifikant (P > 0,05)
Både G. duodenalis och de GEV som den utsöndrar aktiverar NLRP3-inflammasomen och reglerar värdinflammatoriska svar in vitro.Rollen för NLRP3-inflammasomen i patogeniciteten av G. duodenalis förblir således oklar.För att undersöka denna fråga utformade vi ett experiment mellan möss infekterade med G. duodenalis cysta och möss infekterade med G. duodenalis cysta + MCC950 hämmare behandling och jämförde NLRP3 inflammasom uttryck när de infekterades med G. duodenalis cysta.Ett detaljerat schema för experimentet visas i fig. 3a.Förändringar i kroppsvikt hos möss i olika behandlingsgrupper övervakades i 7 dagar efter infektion med cystor, och resultaten visas i Fig. 3b.Jämfört med gruppen som behandlats med ren PBS visade resultaten att (i) kroppsvikten för möss infekterade med G. duodenalis cysta minskade från dag 3 till dag 7 efter infektion;(ii) behandling med MCC950-hämmaren hade ingen signifikant effekt på kroppsvikten hos mössen..Jämfört med den enstaka infektionsgruppen minskade BW för duodenalinfektionsgruppen som behandlades med MCC950 i varierande grad (Dag 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Dag 2: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; (3, 24)=0,6497, P=0,0645;Dessa data visar att NLRP3-inflammasomen skyddar möss från betydande viktminskning i de tidiga stadierna (2-4 dagar) av duodenal infektion.Vi syftade sedan till att detektera G. duodenalis trofozoiter i duodenal lavagevätska och resultaten visas i figur 3c.Jämfört med G. duodenalis-cystainfektionsgruppen ökade antalet trofozoiter i duodenum signifikant efter blockering av NLRP3-inflammasomen (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Duodenala vävnader färgade med HE visade, jämfört med negativ kontroll behandlad med PBS och MCC950 enbart: (i) G. duodenalis cystinfektion resulterade i skada på duodenal villi (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488 ) och kryptatrofi (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum från möss infekterade med G. duodenalis-cystor och behandlade med MCC950-hämmare.duodenal villi var skadad och död (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) med atrofi och kryptförgrening (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) .Dessa resultat tyder på att NLRP3-inflammasomen spelar en roll för att minska patogeniciteten hos G. duodenalis.
Rollen för NLRP3-inflammasom i Giardia duodenuminfektion.Möss gavs (iv) med duodenokockcystor och behandlades sedan med eller utan MCC950 (ip).Enstaka behandlingsgrupper med PBS eller MCC950 användes som kontroller.Experimentell grupp och behandlingsregim.b Kroppsvikten hos möss i var och en av de olika behandlingsgrupperna övervakades under 7 dagar.Skillnaden mellan G. duodenalis-infektionsgruppen och G. duodenalis + MCC950-infektionsbehandlingsgruppen analyserades med t-test med SPSS-programversion 22.0.Asterisker indikerar signifikanta skillnader vid *P<0,05, **P<0,01 eller ***P<0,001.c Parasitisk belastning bestämdes genom att räkna antalet trofozoiter i duodenal lavagevätska.Skillnaden mellan G. duodenalis-infektionsgruppen och G. duodenalis + MCC950-infektionsbehandlingsgruppen analyserades med t-test med SPSS-programversion 22.0.Asterisker indikerar signifikanta skillnader vid *P < 0,05.d Hematoxylin och eosin (H&E) färgningsresultat av duodenal histopatologi.Röda pilar indikerar skada på villi, gröna pilar indikerar skada på krypterna.Skalstång: 100 µm.e, f Statistisk analys av duodenal villus höjd och muskrypt höjd.Asterisker indikerar signifikanta skillnader vid *P<0,05 och **P<0,01.Resultaten är hämtade från 7 oberoende biologiska experiment.BW, kroppsvikt;ig, intragastrisk leveransväg;ip, intraperitoneal leveransväg;ns, inte signifikant (P > 0,05);PBS, fosfatbuffrad saltlösning;WT, vildtyp
Utsöndringen av IL-1β är ett kännetecken för inflammationsaktivering.För att avgöra om G. duodenalis alfa-2-giardin och alfa-7.3-giardin aktiverar NLRP3-värdinflammasomen in vivo, använde vi obehandlade WT-möss (skengrupp) och NLRP3-inflammasomblockerade möss (MCC950-hämmad behandlingsgrupp).Ett detaljerat schema för experimentet visas i fig. 4a.Experimentella grupper bestod av möss behandlade med PBS, G. duodenalis cystabehandling genom sondmatning, intramuskulär injektion av pcDNA3.1 och intramuskulär injektion av pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin eller pcDNA3.1-alfa-7.3-giardin.På den 7:e dagen efter intramuskulär administrering av den rekombinanta plasmiden uppsamlades serum och nivån av IL-ip i varje grupp bestämdes.Som visas i figur 4b, i MOCK-gruppen: (i) jämfört med PBS-gruppen, hade pcDNA3.1-behandling ingen signifikant effekt på IL-1β-utsöndring (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), dock, IL-β-sekretion var signifikant förhöjd i G. duodenalis-cystagruppen (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2-giardin och pcDNA3.1- Intramuskulär injektion av alfa-7,3-giardin ökade signifikant serum-IL-1β-nivåer (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3-giardin inducerade höga nivåer av IL-1β-sekretion i den intramuskulära injektionsgruppen för pcDNA3.1-alfa-2-giardin (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Jämfört med varje grupp i MCC950-behandlingsgruppen och MOCK-gruppen: (i) IL-1β-utsöndringsnivåerna i PBS-kontrollgruppen och pcDNA3.1-kontrollgruppen minskade i viss utsträckning efter att ha blockerat MCC950-hämmaren, men skillnaden var inte signifikant (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) efter blockering av MCC950., reducerades IL-1β-sekretionen signifikant i den G. duodenalis cystainfekterade gruppen, pcDNA3.1-alfa-2-giardingruppen och pcDNA3.1-alfa-7.3-giardingruppen (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3,1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447, pcDNA3,1-alfa-7,3 giardin: ANOVA 5, F(9; 30 (P) = 3,540, P = 0,0164).Dessa resultat tyder på att alfa-2-giardin och alfa-7.3-giardin förmedlar aktiveringen av NLRP3-inflammasomen in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardiner aktiverar NLRP3-värdinflammasomen in vivo.Möss immuniserades (IM) med rekombinant eukaryot expressionsplasmid pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin eller pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardin och behandlades sedan med MCC950 (ip; MCC950-grupp) eller inte (dummy-grupp) ).PBS- eller pcDNA3.1(+)-plasmidbehandlingsgruppen användes som en negativ kontroll, G. duodenalis cystabehandlingsgruppen användes som en positiv kontroll.Experimentell grupp och behandlingsregim.b Serumnivåer av IL-1β i möss mättes på dag 7 med ELISA-analys.Skillnader mellan grupper i MOCK-gruppen analyserades med envägs ANOVA, och skillnader mellan MOCK-gruppen och MCC950-gruppen analyserades med t-testet av SPSS-programversion 22.0.Asterisker indikerar signifikanta skillnader mellan behandlingsgrupper i MOCK-gruppen, *P<0,05 och ***P<0,001;dollartecken ($) indikerar signifikanta skillnader mellan varje grupp i MOCK-gruppen och MCC950-gruppen vid P<0,05.Resultat av sju oberoende biologiska experiment.i, intramuskulär injektion, ns, inte signifikant (P > 0,05)
För att undersöka effekten av alfa-2- och alfa-7.3-giardin-medierad aktivering av NLRP3-värdinflammasomen på G. duodenalis-infektivitet, använde vi WT C57BL/6-möss och injicerade alfa-2-giardin och alfa-7.3-giardin.plasmiden injicerades intramuskulärt efter 3 dagar genom magslangen på G. duodenalis-cystan, varefter mössen observerades under 7 dagar.Ett detaljerat schema för experimentet visas i fig. 5a.Kroppsvikten för varje mus mättes varje dag, prover av färsk tolvfingertarmsvävnad samlades in den 7:e dagen efter administrering genom en magsond, antalet trofozoiter mättes och histopatologiska förändringar observerades.Som visas i figur 5b, med ökande matningstid, ökade BW hos möss i varje grupp gradvis.MT för möss började minska på den 3:e dagen efter intragastrisk administrering av G. duodenalis-cystor och ökade sedan gradvis.Aktivering av NLRP3-inflammasomen inducerad genom intramuskulär injektion av alfa-2-giardin och alfa-7.3-giardin försvagade signifikant viktminskning hos möss (Dag 1: pcDNA3.1-alfa-2-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Dag 1: pcDNA3.1-alfa-7.3-giardin, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Dag 2: pcDNA3.1-alfa-2-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dag 3: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 Dag 4: pcDNA3,1-alfa-2 giardin; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Dag 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Dag 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dag 5: pcDNA3,1-alfa -7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dag 6: pcDNA3. alfa-2-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, dag 6: pcDNA3.1-alfa-7.3-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dag 7: pcDNA3.1-alfa-2-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Dag 7: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Den parasitära belastningen bedömdes i tolvfingertarmen (Fig. 5c).Jämfört med den obehandlade positiva kontrollen och gruppen som injicerades med den tomma pcDNA3.1-vektorn, minskade antalet G. duodenalis trofozoiter signifikant i grupperna som injicerades med α-2-giardin och α-7,3-giardin (pcDNA3.1-alfa) -2-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3,1-alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Dessutom var giardine alfa-7,3 mer skyddande hos möss än giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Resultaten av HE-färgning visas i fig.5d–f.Möss injicerade med alfa-2-giardine och alfa-7.3-giardine hade färre duodenala vävnadsskador, manifesterade av villusskada, jämfört med möss injicerade med G. duodenalis och möss injicerade med G. duodenalis i kombination med en tom pcDNA3-vektor .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 eller P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7,3-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 eller P = 0,0055) och reducerad kryptatrofi (pcDNA3.1-alfa-2-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 eller P = 0,0158; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin: ANOVA F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 eller P = 0,0191).Dessa resultat tyder på att alfa-2-giardin och alfa-7,3-giardin minskar smittsamheten hos G. duodenalis genom att aktivera NLRP3-inflammasomen in vivo.
Rollen för pcDNA3.1(+)-giardiner i G. duodenalis-infektion.Möss immuniserades (IM) med rekombinanta eukaryota expressionsplasmider pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin eller pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardin och utmanades sedan med G. duodenalis-cystor (ig).PBS-gruppen och pcDNA3.1(+) + duodenal cysta behandlingsgruppen användes som negativa kontrollgrupper och duodenal cysta behandlingsgruppen användes som positiv kontrollgrupp.Experimentell grupp och behandlingsregim.b MT för möss i var och en av de olika behandlingsgrupperna övervakades under 7 dagar efter utmaning.Asterisker indikerar signifikanta skillnader mellan grupper i G. duodenalis-gruppen och pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardingruppen, *P < 0,05, **P < 0,01 och ***P < 0,001;dollartecknet ($) indikerar en signifikant skillnad mellan varje grupp av G. duodenalis och jardingruppen pcDNA3.1(+)-alpha-7.3, $$P<0.01 och $$$P<0.001.c Parasitisk belastning bestämdes genom att räkna antalet trofozoiter i 1 ml tolvfingertarmsköljning från tolvfingertarmen (3 cm lång) och uttrycktes som antalet parasiter per cm tolvfingertarmen.Skillnader mellan G. duodenalis-infektionsgruppen, pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardingruppen och pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardingruppen analyserades med envägs-ANOVA med SPSS-programversion 22.0.Asterisker indikerar signifikanta skillnader vid **P<0,01 och ***P<0,001.d Histopatologiska förändringar i tolvfingertarmen.Röda pilar indikerar skada på villi, gröna pilar indikerar skada på krypterna.Skalstång: 100 µm.e, f Statistisk analys av mus duodenal villus höjd (e) och krypta höjd (f).Skillnader mellan grupperna i figur 1d analyserades med envägs ANOVA med SPSS-programversion 22.0.Asterisker indikerar signifikanta skillnader vid *P<0,05 och **P<0,01.Resultat av sju oberoende biologiska experiment.ns, inte signifikant (P > 0,05)
Giardia duodenum är en välkänd tarmparasit hos människor och andra däggdjur som orsakar giardiasis.2004 inkluderades det i WHO:s initiativ för neglected Diseases på grund av dess höga prevalens under 6 år, särskilt i samhällen med låg socioekonomisk status [32].Det medfödda immunsystemet spelar en avgörande roll i immunsvaret på G. duodenalis-infektion.Musmakrofager har rapporterats sluka och döda G. duodenalis genom att släppa extracellulära fällor [33].Våra tidigare studier har visat att G. duodenalis, en icke-invasiv extracellulär parasit, aktiverar p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 och NLRP3 inflammatoriska signalvägar i musmakrofager för att reglera värdinflammatoriska svar, och frisatt GEV kan förstärka denna process.13], 24].De exakta PAMPs som är involverade i NLRP3-inflammasomreglerad inflammation i GEV och rollen av NLRP3-inflammasom i giardiasis återstår dock att klarläggas.För att belysa dessa två frågor har vi genomfört denna studie.
NLRP3-inflammasomen finns i immuncellers cytoplasma och kan aktiveras av olika partiklar som urinsyrakristaller, toxiner, bakterier, virus och parasiter.I bakteriestudier har toxiner identifierats som viktiga PAMPs som aktiverar inflammatoriska sensorer, vilket leder till inflammation och celldöd [34].Vissa strukturellt olika toxiner, såsom hemolysin från Staphylococcus aureus [35] och Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) från enterotoxin (NHE) [37], inducerar aktiveringen av NLRP3-inflammation.Virala studier har visat att virulensproteiner som SARS-COV-2-hölje (E)-protein [38] och Zika-virus NS5-protein [39] är viktiga PAMPs som känns igen av NLRP3-receptorn.I parasitstudier har många parasiter rapporterats vara associerade med värdinflammasomaktivering, såsom Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] och Leishmania [42].De täta granulproteinerna GRA35, GRA42 och GRA43, associerade med virulensen hos Toxoplasma gondii, krävs för induktion av pyroptos i Lewis-råttmakrofager [43].Dessutom har vissa Leishmania-studier fokuserat på individuella molekyler involverade i NLRP3-inflammasomen, såsom parasitmembranlipofosfoglykan [44] eller zinkmetalloproteas [45].Bland den annexinliknande alfa-giardinfamiljen av gener har alfa-1 giardin visats vara en potentiell vaccinkandidat som ger skydd mot G. duodenalis i en musmodell [18].I vår studie valde vi G. duodenalis virulensfaktorer alfa-2 och alfa-7,3 giardiner, som är unika för giardia men relativt mindre rapporterade.Dessa två målgener klonades in i pcDNA3.1(+) eukaryota expressionssystemvektor för analys av inflammationsaktivering.
I vår musmodell tjänar kluvna kaspasfragment som markörer för inflammatorisk aktivering.Vid stimulering interagerar NLRP3 med ASC, rekryterar prokaspaser och genererar aktiva kaspaser som klyver pro-IL-1β och pro-IL-18 till mogen IL-1β och IL-18, respektive -18.Inflammatoriska kaspaser (kaspaser-1, -4, -5 och -11) är en konserverad familj av cysteinproteaser som är kritiska för medfödda försvar och är involverade i inflammation och programmerad celldöd [46].Kaspas-1 aktiveras av kanoniska inflammasomer [47], medan kaspaser-4, -5 och -11 klyvs under bildandet av atypiska inflammasomer [48].I denna studie använde vi peritoneala makrofager från mus som modell och undersökte p20-kaspas-1-klyvd kaspas-1 som en markör för aktivering av värd-NLRP3-inflammation i studier av G. duodenalis-infektion.Resultaten visade att många alfa-giardiner är ansvariga för den typiska aktiveringen av inflammation, vilket är förenligt med upptäckten av viktiga virulensmolekyler involverade i bakterier och virus.Vår studie är dock bara en preliminär screening och det finns andra molekyler som kan aktivera icke-klassiska inflammasomer, eftersom vår tidigare studie fann både klassiska och icke-klassiska inflammasomer vid G. duodenalis-infektion [13].För att ytterligare bestämma om det genererade p20-kaspas-1 är associerat med NLRP3-inflammasomen, transfekterade vi alfa-2 och alfa-7.3 giardiner till peritoneala musmakrofager för att bestämma uttrycksnivåer för nyckelmolekylproteiner och ASC-oligomeriseringsnivåer, vilket bekräftar att båda a-giardinerna aktiveras inflammasom NLRP3.Våra resultat skiljer sig något från de från Manko-Prykhoda et al., som rapporterade att stimulering av Caco-2-celler med enbart G. muris eller E. coli EPEC-stammar kan öka fluorescensintensiteten för NLRP3, ASC och caspase-1, men inte signifikant, medan hur samstimulering av G. muris och E. coli ökade nivåerna av tre proteiner [49].Denna diskrepans kan bero på skillnader i urvalet av Giardia-arter, cellinjer och primära celler.Vi utförde också in vivo-analyser med MCC950 i 5 veckor gamla WT C57BL/6 honmöss, som är mer mottagliga för G. duodenalis.MCC950 är en potent och selektiv NLRP3-hämmare med liten molekyl som blockerar kanonisk och icke-kanonisk NLRP3-aktivering vid nanomolära koncentrationer.MCC950 hämmar NLRP3-aktivering men påverkar inte aktiveringen av AIM2-, NLRC4- och NLRP1-inflammatoriska vägar eller TLR-signalvägar [27].MCC950 blockerar NLRP3-aktivering men hämmar inte NLRP3-initiering, K+-utflöde, Ca2+-inflöde eller interaktionen mellan NLRP3 och ASC;istället hämmar det NLRP3-inflammasomaktivering genom att blockera ASC-oligomerisering [27].Därför använde vi MCC950 i en in vivo-studie för att bestämma rollen för NLRP3-inflammasomen efter giardininjektion.Aktiverat kaspas-1 p10 klyver pro-inflammatoriska cytokiner pro-IL-1β och pro-IL-18 till mogen IL-1β och IL-18 [50].I denna studie användes serum-IL-1β-nivåer i giardinbehandlade möss med eller utan MCC950 som en indikator på om NLRP3-inflammasomen var aktiverad.Som väntat minskade MCC950-behandling signifikant serum-IL-1β-nivåerna.Dessa data visar tydligt att G. duodenalis giardin alfa-2 och giardin alfa-7.3 kan aktivera NLRP3-musinflammasomen.
Betydande data som samlats under det senaste decenniet har visat att IL-17A är huvudregulatorn av immunitet mot G. muris, inducerar IL-17RA-signalering, producerar antimikrobiella peptider och reglerar komplementaktivering [51].Giardia-infektion förekommer dock oftare hos unga vuxna, och det har rapporterats att Giardia-infektion hos unga möss inte aktiverar IL-17A-svaret för att utöva sin skyddande effekt [52], vilket fick forskare att leta efter andra immunmodulerande Giardia.mekanismer för helmintinfektion.Författarna till en nyligen genomförd studie rapporterade att G. muris kan aktivera NLRP3-inflammasomen av E. coli EPEC, vilket främjar produktionen av antimikrobiella peptider och minskar dess vidhäftningsförmåga och antalet trofozoiter i tarmkanalen, och därigenom minska tjocktarmens svårighetsgrad. sjukdomar orsakade av baciller [49].NLRP3-inflammasomen är involverad i utvecklingen av olika sjukdomar.Studier har visat att Pseudomonas aeruginosa utlöser autofagi i makrofager för att undvika celldöd, och denna process beror på aktiveringen av NLRP3-inflammasomen [53].För N. caninum begränsar reaktiva syrearter-medierad aktivering av NLRP3-inflammasomen dess replikation i värden, vilket gör den till ett potentiellt terapeutiskt mål [9].Paracoccidioides brasiliensis har visat sig inducera aktiveringen av NLRP3-inflammasomen i musbenmärgshärledda dendritiska celler, vilket resulterar i frisättningen av den inflammatoriska cytokinen IL-1β, som spelar en avgörande roll i värdförsvaret [10].Flera Leishmania-arter, inklusive L. amazonensis, L. major, L. braziliensis och L. infantum chagasi, aktiverar NLRP3 och ASC-beroende kaspas-1 i makrofager, såväl som Leishmania-infektion.Parasitreplikation förstärks hos möss som saknar NLRP3/ASC/caspase-1-genen [11].Zamboni et al.Leishmania-infektion har rapporterats inducera aktivering av NLRP3-inflammasomen i makrofager, vilket begränsar intracellulär parasitreplikation.Således kan Leishmania hämma NLRP3-aktivering som en undvikandestrategi.I in vivo-studier bidrog NLRP3-inflammasomen till elimineringen av Leishmania, men påverkade inte vävnader [54].Omvänt, i helminthiasisstudier, undertryckte aktivering av NLRP3-inflammasomen värdens skyddande immunitet mot gastrointestinal helminthiasis [12].Shigella är en av de viktigaste bakterierna som orsakar diarré över hela världen.Dessa bakterier kan inducera IL-1β-produktion genom P2X7-receptormedierat K+-utflöde, reaktiva syrearter, lysosomal försurning och mitokondriell skada.NLRP3-inflammasomen reglerar negativt fagocytos och bakteriedödande aktivitet hos makrofager mot Shigella [55].Plasmodiumstudier har visat att möss med AIM2-, NLRP3- eller kaspas-1-brist infekterade med Plasmodium producerar höga nivåer av typ 1-interferon och är mer resistenta mot Plasmodium-infektion [56].Rollen för alfa-2-giardin och alfa-7.3-giardin för att inducera patogen aktivering av NLRP3-inflammation hos möss är dock oklar.
I denna studie minskade hämning av NLRP3-inflammasomen av MCC950 BW och ökade antalet trofozoiter i tarmsköljvätska hos möss, vilket resulterade i allvarligare patologiska förändringar i duodenal vävnad.Alfa-2-giardin och alfa-7.3-giardin aktiverar värdmus-NLRP3-inflammasomen, ökar musens kroppsvikt, minskar antalet trofozoiter i tarmsköljvätska och lindrar patologiska duodenalasioner.Dessa resultat tyder på att G. duodenalis kan aktivera NLRP3-värdinflammasomen via alfa-2-giardin och alfa-7,3-giardin, vilket minskar patogeniciteten hos G. duodenalis hos möss.
Sammantaget visar våra resultat att alfa-2 och alfa-7.3 giardiner inducerar aktiveringen av NLRP3-värdinflammasomen och minskar smittsamheten hos G. duodenalis hos möss.Därför är dessa molekyler lovande mål för att förebygga giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: en översikt.Det avslöjades nyligen att Pat Inflamm är allergisk mot droger.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: en översyn av farmakoterapi.Expertutlåtande från en farmaceut.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, läkemedelsresistens och upptäckten av nya mål.Infekterar Disord läkemedelsmål.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, etc. NLRP3 inflammatoriska och inflammatoriska sjukdomar.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Inflammasomens roll vid tarminflammation och cancer.Gastroenterologi.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanonisk och atypisk NLRP3-inflammasomaktivering vid korsningen av immuntolerans och tarminflammation.pre-immun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-medierad NLRP3-inflammasomaktivering är involverad som svar på N. caninum-infektion.Parasit vektor.2020;13:449.