Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Genvektorer för behandling av pulmonell cystisk fibros måste riktas mot de ledande luftvägarna, eftersom perifer lungtransduktion inte har någon terapeutisk effekt.Effektiviteten av viral transduktion är direkt relaterad till uppehållstiden för bäraren.Emellertid diffunderar tillförselvätskor såsom genbärare naturligt in i alveolerna under inhalation, och terapeutiska partiklar av vilken form som helst avlägsnas snabbt genom mucociliär transport.Att förlänga uppehållstiden för genbärare i luftvägarna är viktigt men svårt att uppnå.Bärarkonjugerade magnetiska partiklar som kan riktas mot ytan av luftvägarna kan förbättra regional målinriktning.På grund av problem med in vivo-avbildning är beteendet hos sådana små magnetiska partiklar på luftvägsytan i närvaro av ett applicerat magnetfält dåligt förstått.Syftet med denna studie var att använda synkrotronavbildning för att visualisera in vivo rörelsen av en serie magnetiska partiklar i luftstrupen på sövda råttor för att studera dynamiken och beteendemönstren för enstaka och bulkpartiklar in vivo.Vi bedömde sedan också om leverans av lentivirala magnetiska partiklar i närvaro av ett magnetfält skulle öka effektiviteten av transduktion i råttluftstrupen.Synkrotronröntgen visar beteendet hos magnetiska partiklar i stationära och rörliga magnetfält in vitro och in vivo.Partiklar kan inte lätt dras över ytan av levande luftvägar med hjälp av magneter, men under transport koncentreras avlagringar i synfältet, där magnetfältet är starkast.Transduktionseffektiviteten ökades också sex gånger när lentivirala magnetiska partiklar levererades i närvaro av ett magnetfält.Sammantaget tyder dessa resultat på att lentivirala magnetiska partiklar och magnetfält kan vara värdefulla metoder för att förbättra genvektorinriktning och transduktionsnivåer i de ledande luftvägarna in vivo.
Cystisk fibros (CF) orsakas av variationer i en enda gen som kallas CF-transmembrankonduktansregulatorn (CFTR).CFTR-proteinet är en jonkanal som finns i många epitelceller i hela kroppen, inklusive luftvägarna, en viktig plats i patogenesen av cystisk fibros.Defekter i CFTR leder till onormal vattentransport, uttorkning av luftvägsytan och minskat djup för luftvägsytans vätskeskikt (ASL).Det försämrar också förmågan hos det mucociliära transportsystemet (MCT) att rensa luftvägarna från inhalerade partiklar och patogener.Vårt mål är att utveckla en lentiviral (LV) genterapi för att leverera den korrekta kopian av CFTR-genen och förbättra ASL, MCT och lunghälsa, och att fortsätta utveckla ny teknik som kan mäta dessa parametrar in vivo1.
LV-vektorer är en av de ledande kandidaterna för genterapi för cystisk fibros, främst för att de permanent kan integrera den terapeutiska genen i luftvägarnas basala celler (luftvägsstamceller).Detta är viktigt eftersom de kan återställa normal hydrering och slemrensning genom att differentiera till funktionella genkorrigerade luftvägsytceller associerade med cystisk fibros, vilket resulterar i livslånga fördelar.LV-vektorer måste riktas mot de ledande luftvägarna, eftersom det är här lungengagemanget vid CF börjar.Leverans av vektorn djupare in i lungan kan resultera i alveolär transduktion, men detta har ingen terapeutisk effekt vid cystisk fibros.Vätskor som genbärare migrerar emellertid naturligt in i alveolerna när de andas in efter förlossningen3,4 och terapeutiska partiklar stöts snabbt ut i munhålan av MCT.Effektiviteten av LV-transduktion är direkt relaterad till hur lång tid vektorn förblir nära målcellerna för att möjliggöra cellulärt upptag - "uppehållstid" 5 som lätt förkortas av typiskt regionalt luftflöde samt koordinerat upptag av slem och MCT-partiklar.För cystisk fibros är förmågan att förlänga LV-uppehållstiden i luftvägarna viktig för att uppnå höga nivåer av transduktion i detta område, men har hittills varit utmanande.
För att övervinna detta hinder föreslår vi att LV-magnetiska partiklar (MP) kan hjälpa till på två komplementära sätt.För det första kan de styras av en magnet till luftvägsytan för att förbättra inriktningen och hjälpa genbärarpartiklar att vara i rätt område av luftvägen;och ASL) flyttar in i cellskikt 6. MP:er används i stor utsträckning som riktade läkemedelstillförselvehiklar när de binder till antikroppar, kemoterapiläkemedel eller andra små molekyler som fäster till cellmembran eller binder till sina respektive cellytreceptorer och ackumuleras vid tumörställen i förekomst av statisk elektricitet.Magnetiska fält för cancerterapi 7. Andra "hypertermiska" metoder syftar till att döda tumörceller genom att värma MP när de utsätts för oscillerande magnetfält.Principen för magnetisk transfektion, där ett magnetfält används som ett transfektionsmedel för att förbättra överföringen av DNA till celler, används vanligtvis in vitro med användning av en rad icke-virala och virala genvektorer för svårtransducerade cellinjer ..Effektiviteten av LV-magnetotransfektion med tillförsel av LV MP in vitro till en cellinje av humant bronkialepitel i närvaro av ett statiskt magnetfält fastställdes, vilket ökade transduktionseffektiviteten med 186 gånger jämfört med enbart LV-vektorn.LV MT har också applicerats på en in vitro-modell av cystisk fibros, där magnetisk transfektion ökade LV-transduktion i luft-vätskegränssnittskulturer med en faktor 20 i närvaro av cystisk fibros sputum10.In vivo organmagnetotransfektion har dock fått relativt lite uppmärksamhet och har endast utvärderats i ett fåtal djurstudier11,12,13,14,15, särskilt i lungorna16,17.Möjligheterna till magnetisk transfektion vid lungterapi vid cystisk fibros är dock tydliga.Tan et al.(2020) uttalade att "en valideringsstudie om effektiv pulmonell leverans av magnetiska nanopartiklar kommer att bana väg för framtida CFTR-inhalationsstrategier för att förbättra kliniska resultat hos patienter med cystisk fibros"6.
Beteendet hos små magnetiska partiklar på ytan av andningsvägarna i närvaro av ett applicerat magnetfält är svårt att visualisera och studera, och därför är de dåligt förstådda.I andra studier har vi utvecklat en Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) metod för icke-invasiv avbildning och kvantifiering av små in vivo-förändringar i ASL18-djup och MCT19-beteende,20 för att direkt mäta gaskanalythydratisering och används som en tidig indikator för behandlingseffektivitet.Dessutom använder vår MCT-värderingsmetod partiklar med en diameter på 10–35 µm bestående av aluminiumoxid eller glas med högt brytningsindex som MCT-markörer synliga med PB-PCXI21.Båda metoderna är lämpliga för att avbilda en rad partikeltyper, inklusive MP.
På grund av den höga rumsliga och tidsmässiga upplösningen är våra PB-PCXI-baserade ASL- och MCT-analyser väl lämpade för att studera dynamiken och beteendemönstren för enstaka och bulkpartiklar in vivo för att hjälpa oss att förstå och optimera MP-genleveransmetoder.Tillvägagångssättet vi använder här är baserat på våra studier med SPring-8 BL20B2-strållinjen, där vi visualiserade vätskerörelser efter leverans av en dos av en dummy-vektor i näs- och lungluftvägarna hos möss för att hjälpa till att förklara våra heterogena genuttrycksmönster som observerats i vår gen.djurstudier med en bärardos på 3,4 .
Syftet med denna studie var att använda PB-PCXI-synkrotronen för att visualisera in vivo-rörelser av en serie MPs i luftstrupen hos levande råttor.Dessa PB-PCXI-avbildningsstudier utformades för att testa MP-serien, magnetfältets styrka och plats för att bestämma deras effekt på MP-rörelsen.Vi antog att ett externt magnetfält skulle hjälpa den levererade MF att stanna eller flytta till målområdet.Dessa studier gjorde det också möjligt för oss att bestämma magnetkonfigurationer som maximerar mängden partiklar som finns kvar i luftstrupen efter avsättning.I en andra serie studier syftade vi till att använda denna optimala konfiguration för att demonstrera transduktionsmönstret som är ett resultat av in vivo-leverans av LV-MPs till råttans luftvägar, under antagandet att leverans av LV-MPs i samband med luftvägsinriktning skulle resultera. i ökad LV-transduktionseffektivitet..
Alla djurstudier utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av University of Adelaide (M-2019-060 och M-2020-022) och SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.Experimenten utfördes i enlighet med rekommendationerna från ARRIVE.
Alla röntgenbilder togs vid BL20XU-strållinjen vid SPring-8-synkrotronen i Japan med en uppsättning liknande den som beskrivits tidigare21,22.I korthet var experimentlådan belägen 245 m från synkrotronlagringsringen.Ett prov-till-detektoravstånd på 0,6 m används för partikelavbildningsstudier och 0,3 m för in vivo-avbildningsstudier för att skapa faskontrasteffekter.En monokromatisk stråle med en energi på 25 keV användes.Bilderna togs med hjälp av en högupplöst röntgenomvandlare (SPring-8 BM3) kopplad till en sCMOS-detektor.Givaren omvandlar röntgenstrålar till synligt ljus med hjälp av en 10 µm tjock scintillator (Gd3Al2Ga3O12), som sedan riktas till sCMOS-sensorn med hjälp av ett ×10 (NA 0,3) mikroskopobjektiv.sCMOS-detektorn var en Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) med en arraystorlek på 2048 × 2048 pixlar och en rå pixelstorlek på 6,5 × 6,5 µm.Denna inställning ger en effektiv isotropisk pixelstorlek på 0,51 µm och ett synfält på cirka 1,1 mm × 1,1 mm.Exponeringslängden på 100 ms valdes för att maximera signal-brusförhållandet för magnetiska partiklar inuti och utanför luftvägarna samtidigt som rörelseartefakter som orsakas av andning minimeras.För in vivo-studier placerades en snabb röntgenslutare i röntgenvägen för att begränsa stråldosen genom att blockera röntgenstrålen mellan exponeringarna.
LV-media användes inte i några SPring-8 PB-PCXI-avbildningsstudier eftersom BL20XU-bildkammaren inte är certifierad på biosäkerhetsnivå 2.Istället valde vi en rad välkarakteriserade parlamentsledamöter från två kommersiella leverantörer som täcker en rad olika storlekar, material, järnkoncentrationer och tillämpningar, — först för att förstå hur magnetfält påverkar rörelsen hos parlamentariker i glaskapillärer, och sedan i levande luftvägar.yta.Storleken på MP varierar från 0,25 till 18 µm och är gjord av olika material (se tabell 1), men sammansättningen av varje prov, inklusive storleken på de magnetiska partiklarna i MP, är okänd.Baserat på våra omfattande MCT-studier 19, 20, 21, 23, 24 förväntar vi oss att MP:er ner till 5 µm kan ses på luftrörets luftvägsyta, till exempel genom att subtrahera på varandra följande ramar för att se förbättrad synlighet av MP-rörelser.En enkel MP på 0,25 µm är mindre än bildåtergivningsenhetens upplösning, men PB-PCXI förväntas detektera deras volymetriska kontrast och rörelsen hos ytvätskan på vilken de avsätts efter att de deponerats.
Prover för varje MP i tabellen.1 bereddes i 20 μl glaskapillärer (Drummond Microcaps, PA, USA) med en innerdiameter på 0,63 mm.Corpuskulära partiklar finns i vatten, medan CombiMag-partiklar finns i tillverkarens egenutvecklade vätska.Varje rör fylls till hälften med vätska (cirka 11 µl) och placeras på provhållaren (se figur 1).Glaskapillärerna placerades horisontellt på scenen i bildkammaren respektive och placerades vid vätskans kanter.En 19 mm diameter (28 mm lång) nickelskalmagnet gjord av sällsynta jordartsmetaller, neodym, järn och bor (NdFeB) (N35, kat.nr LM1652, Jaycar Electronics, Australien) med en remanens på 1,17 T fästes på en separat överföringstabell för att uppnå. Ändra din position på distans under renderingen.Röntgenavbildning börjar när magneten är placerad ungefär 30 mm ovanför provet och bilder tas med 4 bilder per sekund.Under avbildning fördes magneten nära glaskapillärröret (på ett avstånd av cirka 1 mm) och flyttades sedan längs röret för att bedöma effekten av fältstyrka och position.
En in vitro-avbildningsuppsättning som innehåller MP-prover i glaskapillärer vid översättningsstadiet av xy-provet.Röntgenstrålens väg är markerad med en röd prickad linje.
När in vitro-synligheten för MPs etablerades testades en undergrupp av dem in vivo på Wistar-albinoråttor av vildtyp (~12 veckor gamla, ~200 g).Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) och butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Råttor bedövades med Pharma (Japan)-blandning genom intraperitoneal injektion.Efter anestesi förbereddes de för avbildning genom att ta bort pälsen runt luftstrupen, föra in en endotrakealtub (ET; 16 Ga intravenös kanyl, Terumo BCT) och immobilisera dem i ryggläge på en skräddarsydd bildplatta innehållande en värmepåse för att hålla kroppstemperaturen.22. Avbildningsplattan fästes sedan på provstadiet i bildlådan i en liten vinkel för att rikta in luftstrupen horisontellt på röntgenbilden som visas i figur 2a.
(a) In vivo-avbildningsinställning i SPring-8-bildenheten, röntgenstråleväg markerad med röd prickad linje.(b,c) Trakealmagnetlokalisering utfördes på distans med hjälp av två ortogonalt monterade IP-kameror.På vänster sida av bilden på skärmen kan du se trådöglan som håller huvudet och leveranskanylen installerad inuti ET-röret.
Ett fjärrstyrt sprutpumpsystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) som använder en 100 µl glasspruta ansluts till en PE10-slang (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) med en 30 Ga nål.Markera röret för att säkerställa att spetsen är i rätt position i luftstrupen när endotrakealtuben sätts in.Med hjälp av en mikropump avlägsnades sprutkolven och spetsen på röret nedsänktes i MP-provet som skulle levereras.Det laddade leveransröret sattes sedan in i endotrakealtuben, vilket placerade spetsen vid den starkaste delen av vårt förväntade applicerade magnetfält.Bildinsamlingen kontrollerades med hjälp av en andningsdetektor ansluten till vår Arduino-baserade timingbox, och alla signaler (t.ex. temperatur, andning, slutare öppna/stäng och bildinsamling) registrerades med Powerlab och LabChart (AD Instruments, Sydney, Australien) 22 Vid bildbehandling När höljet inte var tillgängligt placerades två IP-kameror (Panasonic BB-SC382) i ungefär 90° från varandra och användes för att styra magnetens position i förhållande till luftstrupen under bildbehandling (Figur 2b, c).För att minimera rörelseartefakter togs en bild per andetag under den terminala andningsflödesplatån.
Magneten är fäst vid det andra steget, som kan vara placerat på avstånd på utsidan av avbildningskroppen.Olika positioner och konfigurationer av magneten testades, inklusive: placerad i en vinkel av ungefär 30° ovanför luftstrupen (konfigurationer visas i figurerna 2a och 3a);en magnet ovanför djuret och den andra under, med polerna inställda för attraktion (Figur 3b)., en magnet ovanför djuret och en under, med polerna inställda för avstötning (Figur 3c), och en magnet ovanför och vinkelrätt mot luftstrupen (Figur 3d).Efter att ha ställt in djuret och magneten och laddat MP:n som testas i sprutpumpen, leverera en dos på 50 µl med en hastighet av 4 µl/sek vid bildtagning.Magneten flyttas sedan fram och tillbaka längs eller över luftstrupen samtidigt som den fortsätter att ta bilder.
Magnetkonfiguration för in vivo-avbildning (a) en magnet ovanför luftstrupen i en vinkel på ungefär 30°, (b) två magneter konfigurerade för attraktion, (c) två magneter konfigurerade för repulsion, (d) en magnet ovanför och vinkelrät mot trakea.Observatören tittade ner från munnen till lungorna genom luftstrupen och röntgenstrålen passerade genom den vänstra sidan av råttan och lämnade den högra sidan.Magneten flyttas antingen längs med luftvägarna eller till vänster och höger ovanför luftstrupen i riktning mot röntgenstrålen.
Vi försökte också bestämma synligheten och beteendet hos partiklar i luftvägarna i frånvaro av blandning av andning och hjärtfrekvens.Därför, i slutet av avbildningsperioden, avlivades djuren humant på grund av överdosering av pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Vissa djur lämnades kvar på bildplattformen, och efter upphörande av andning och hjärtslag upprepades bildbehandlingsprocessen och tillsatte en extra dos MP om ingen MP var synlig på luftvägsytan.
De resulterande bilderna korrigerades för platt och mörkt fält och sattes sedan ihop till en film (20 bilder per sekund; 15–25 × normal hastighet beroende på andningsfrekvens) med hjälp av ett anpassat skript skrivet i MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alla studier på LV-genvektorleverans utfördes vid University of Adelaide Laboratory Animal Research Center och syftade till att använda resultaten från SPring-8-experimentet för att bedöma om LV-MP-leverans i närvaro av ett magnetfält kunde förbättra genöverföringen in vivo .För att utvärdera effekterna av MF och magnetfält, behandlades två grupper av djur: en grupp injicerades med LV MF med magnetplacering, och den andra gruppen injicerades med en kontrollgrupp med LV MF utan magnet.
LV-genvektorer har genererats med användning av tidigare beskrivna metoder 25, 26.LacZ-vektorn uttrycker en nukleär lokaliserad beta-galaktosidasgen som drivs av den konstitutiva promotorn MPSV (LV-LacZ), som producerar en blå reaktionsprodukt i transducerade celler, synlig på fronter och sektioner av lungvävnad.Titrering utfördes i cellkulturer genom att manuellt räkna antalet LacZ-positiva celler med användning av en hemocytometer för att beräkna titern i TU/ml.Bärare kryokonserveras vid -80°C, tinas före användning och binds till CombiMag genom att blanda 1:1 och inkubera på is i minst 30 minuter före leverans.
Normala Sprague Dawley-råttor (n = 3/grupp, ~2-3 sövda ip med en blandning av 0,4mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Australien) och 60mg/kg ketamin (Ilium, Australien) vid 1 månads ålder) ip ) injektion och icke-kirurgisk oral kanyl med en 16 Ga intravenös kanyl.För att säkerställa att trakeal luftvägsvävnad tar emot LV-transduktion, konditionerades den med vårt tidigare beskrivna mekaniska störningsprotokoll där luftrörets luftvägsyta gnuggades axiellt med en trådkorg (N-Circle, nitinolstensextraktor utan spets NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, USA) 30 s28.Sedan, cirka 10 minuter efter störningen i biosäkerhetsskåpet, utfördes trakeal administrering av LV-MP.
Magnetfältet som användes i detta experiment konfigurerades på samma sätt som en röntgenstudie in vivo, med samma magneter som hölls över luftstrupen med destillationsstentklämmor (Figur 4).En volym på 50 µl (2 x 25 µl alikvoter) av LV-MP tillfördes till luftstrupen (n = 3 djur) med användning av en pipett med gelspets som beskrivits tidigare.Kontrollgruppen (n = 3 djur) fick samma LV-MP utan användning av en magnet.Efter avslutad infusion avlägsnas kanylen från endotrakealtuben och djuret extuberas.Magneten sitter kvar i 10 minuter innan den tas bort.Råttor doserades subkutant med meloxikam (1 ml/kg) (Ilium, Australien) följt av anestesiabstinens genom intraperitoneal injektion av 1 mg/kg atipamazolhydroklorid (Antisedan, Zoetis, Australien).Råttor hölls varma och observerades tills fullständig återhämtning från anestesi.
LV-MP leveransanordning i biologiskt säkerhetsskåp.Du kan se att den ljusgrå Luer-lock-hylsan på ET-röret sticker ut från munnen och gelpipettspetsen som visas i figuren förs in genom ET-röret till önskat djup i luftstrupen.
En vecka efter LV-MP-administrationsproceduren avlivades djuren humant genom inandning av 100 % CO2 och LacZ-uttryck utvärderades med vår standard X-gal-behandling.De tre mest kaudala broskringarna togs bort för att säkerställa att eventuell mekanisk skada eller vätskeretention på grund av placering av endotrakealtuben inte skulle inkluderas i analysen.Varje luftstrupe skars på längden för att erhålla två halvor för analys och placerades i en kopp innehållande silikongummi (Sylgard, Dow Inc) med användning av en Minutien-nål (Fine Science Tools) för att visualisera den luminala ytan.Distributionen och karaktären hos de transducerade cellerna bekräftades genom frontal fotografering med användning av ett Nikon-mikroskop (SMZ1500) med en DigiLite-kamera och TCapture-mjukvara (Tucsen Photonics, Kina).Bilder togs med 20x förstoring (inklusive den maximala inställningen för luftstrupens fulla bredd), med hela längden på luftstrupen visade steg för steg, vilket ger tillräckligt med överlappning mellan varje bild för att tillåta bilder att "sys".Bilderna från varje luftstrupe kombinerades sedan till en enda sammansatt bild med hjälp av Composite Image Editor version 2.0.3 (Microsoft Research) med hjälp av planar rörelsealgoritmen. Området för LacZ-uttryck inom de sammansatta trakealbilderna från varje djur kvantifierades med hjälp av ett automatiserat MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) som tidigare beskrivits28, med inställningar på 0,35 < Nyans < 0,58, Mättnad > 0,15 och Värde < 0,7. Området för LacZ-uttryck i de sammansatta trakealbilderna från varje djur kvantifierades med ett automatiserat MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) som tidigare beskrivits28, med inställningar på 0,35 < Nyans < 0,58, Mättnad > 0,15 och Värde < 0,7. Ativt äm значение <0 ,7. Området för LacZ-uttryck i sammansatta trakealbilder från varje djur kvantifierades med hjälp av ett automatiserat MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) som tidigare beskrivits28 med inställningar på 0,350,15 och värde <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复僐徺徺徺徺徺进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置.如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气箈 無 焏 焏 焏 焏 礍表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。... Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определизо определиз ованного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насьщенночено, 75 jun. . Områden med LacZ-uttryck på sammansatta bilder av luftstrupen hos varje djur kvantifierades med ett automatiserat MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) som tidigare beskrivits med inställningar på 0,35 < nyans < 0,58, mättnad > 0,15 och värde < 0,7.Genom att spåra vävnadskonturer i GIMP v2.10.24 skapades en mask manuellt för varje sammansatt bild för att identifiera vävnadsområdet och förhindra eventuella falska upptäckter utanför trakealvävnaden.De färgade områdena från alla sammansatta bilder från varje djur summerades för att ge den totala färgade arean för det djuret.Det målade området dividerades sedan med maskens totala yta för att få en normaliserad yta.
Varje luftstrupe bäddades in i paraffin och sektionerades med en tjocklek av 5 µm.Sektioner motfärgades med neutralt snabbrött i 5 minuter och bilder togs med ett Nikon Eclipse E400-mikroskop, DS-Fi3-kamera och NIS-elementfångstmjukvara (version 5.20.00).
Alla statistiska analyser utfördes i GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistisk signifikans sattes till p ≤ 0,05.Normalitet testades med Shapiro-Wilk-testet och skillnader i LacZ-färgning utvärderades med ett oparat t-test.
De sex MP som beskrivs i Tabell 1 undersöktes med PCXI, och synligheten beskrivs i Tabell 2. Två polystyren MP (MP1 och MP2; 18 µm respektive 0,25 µm) var inte synliga av PCXI, men de återstående proverna kunde identifieras (exempel visas i figur 5).MP3 och MP4 är svagt synliga (10-15 % Fe3O4; 0,25 µm respektive 0,9 µm).Även om MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 µm) innehöll några av de minsta partiklarna som testades, var det den mest uttalade.CombiMag MP6-produkten är svår att urskilja.I alla fall förbättrades vår förmåga att upptäcka MFs avsevärt genom att flytta magneten fram och tillbaka parallellt med kapillären.När magneterna rörde sig bort från kapillären drogs partiklarna ut i långa kedjor, men när magneterna närmade sig och magnetfältsstyrkan ökade förkortades partikelkedjorna när partiklarna migrerade mot kapillärens övre yta (se tilläggsvideo S1 : MP4), vilket ökar partikeldensiteten vid ytan.Omvänt, när magneten tas bort från kapillären, minskar fältstyrkan och MP:erna omarrangeras till långa kedjor som sträcker sig från kapillärens övre yta (se tilläggsvideo S2: MP4).Efter att magneten slutat röra sig fortsätter partiklarna att röra sig en tid efter att ha nått jämviktsläget.När MP rör sig mot och bort från kapillärens övre yta tenderar de magnetiska partiklarna att dra skräp genom vätskan.
Synligheten för MP under PCXI varierar avsevärt mellan proverna.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 och (d) MP6.Alla bilder som visas här togs med en magnet placerad cirka 10 mm direkt ovanför kapillären.De uppenbara stora cirklarna är luftbubblor som är fångade i kapillärerna, vilket tydligt visar faskontrastbildens svarta och vita kantegenskaper.Den röda rutan indikerar förstoringen som förstärker kontrasten.Observera att magnetkretsarnas diametrar i alla figurer inte är skalenliga och är ungefär 100 gånger större än vad som visas.
När magneten rör sig åt vänster och höger längs toppen av kapillären, ändras vinkeln på MP-strängen så att den ligger i linje med magneten (se figur 6), vilket avgränsar magnetfältslinjerna.För MP3-5, efter att ackordet når tröskelvinkeln, drar partiklarna längs kapillärens övre yta.Detta resulterar ofta i att MP:er samlas i större grupper nära där magnetfältet är starkast (se tilläggsvideo S3: MP5).Detta är också särskilt tydligt vid avbildning nära slutet av kapillären, vilket gör att MP aggregerar och koncentreras vid vätske-luft-gränssnittet.Partiklarna i MP6, som var svårare att urskilja än de i MP3-5, släpade inte när magneten rörde sig längs kapillären, utan MP-strängarna dissocierade och lämnade partiklarna i synen (se tilläggsvideo S4: MP6).I vissa fall, när det applicerade magnetfältet reducerades genom att magneten flyttades en lång sträcka från avbildningsplatsen, sjönk eventuella kvarvarande MP långsamt ner till bottenytan av röret genom gravitation, kvar i strängen (se tilläggsvideo S5: MP3) .
Vinkeln på MP-strängen ändras när magneten rör sig till höger ovanför kapillären.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 och (d) MP6.Den röda rutan indikerar förstoringen som förstärker kontrasten.Observera att de ytterligare videorna är för informationsändamål eftersom de avslöjar viktig partikelstruktur och dynamisk information som inte kan visualiseras i dessa statiska bilder.
Våra tester har visat att förflyttning av magneten långsamt fram och tillbaka längs luftstrupen underlättar visualiseringen av MF i samband med komplex rörelse in vivo.Inga in vivo-tester utfördes eftersom polystyrenpärlorna (MP1 och MP2) inte var synliga i kapillären.Var och en av de återstående fyra MF:erna testades in vivo med magnetens långa axel placerad över luftstrupen i en vinkel på cirka 30° mot vertikalen (se figurerna 2b och 3a), eftersom detta resulterade i längre MF-kedjor och var mer effektivt än en magnet..konfigurationen avslutad.MP3, MP4 och MP6 har inte hittats i luftstrupen hos några levande djur.Vid visualisering av luftvägarna hos råttor efter humant dödande av djuren förblev partiklarna osynliga även när ytterligare volym tillsattes med hjälp av en sprutpump.MP5 hade den högsta järnoxidhalten och var den enda synliga partikeln, så den användes för att utvärdera och karakterisera MP-beteende in vivo.
Placering av magneten över luftstrupen under MF-insättning resulterade i att många, men inte alla, MF koncentrerades i synfältet.Trakeal inträngning av partiklar observeras bäst hos humant avlivade djur.Figur 7 och kompletterande video S6: MP5 visar snabb magnetisk infångning och inriktning av partiklar på ytan av den ventrala luftstrupen, vilket indikerar att MP:er kan riktas mot önskade områden i luftstrupen.Vid sökning mer distalt längs luftstrupen efter MF-tillförsel hittades några MF närmare carina, vilket indikerar otillräcklig magnetfältstyrka för att samla in och hålla alla MF, eftersom de levererades genom regionen med maximal magnetfältstyrka under vätskeadministrering.bearbeta.Postnatala MP-koncentrationer var dock högre runt bildområdet, vilket tyder på att många MP:er stannade kvar i luftvägsregioner där den applicerade magnetfältstyrkan var högst.
Bilder av (a) före och (b) efter leverans av MP5 i luftstrupen på en nyligen avlivad råtta med en magnet placerad precis ovanför bildområdet.Det avbildade området ligger mellan två broskringar.Det finns lite vätska i luftvägarna innan MP levereras.Den röda rutan indikerar förstoringen som förstärker kontrasten.Dessa bilder är tagna från videon som visas i S6: MP5 Supplementary Video.
Att flytta magneten längs luftstrupen in vivo resulterade i en förändring av MP-kedjans vinkel på luftvägsytan, liknande den som observeras i kapillärer (se figur 8 och tilläggsvideo S7: MP5).Men i vår studie kunde parlamentsledamöter inte dras längs ytan av levande luftvägar, vilket kapillärer kan göra.I vissa fall förlängs MP-kedjan när magneten rör sig åt vänster och höger.Intressant nog fann vi också att partikelkedjan ändrar djupet på vätskans ytskikt när magneten flyttas längs med luftstrupen och expanderar när magneten flyttas direkt ovanför och partikelkedjan roteras till en vertikal position (se Tilläggsvideo S7).: MP5 vid 0:09, längst ner till höger).Det karakteristiska rörelsemönstret ändrades när magneten flyttades i sidled över luftstrupens topp (dvs till vänster eller höger om djuret, snarare än längs med luftstrupen).Partiklarna var fortfarande tydligt synliga under deras rörelse, men när magneten togs bort från luftstrupen blev spetsarna på partikelsträngarna synliga (se tilläggsvideo S8: MP5, med start 0:08).Detta överensstämmer med det observerade beteendet hos magnetfältet under verkan av ett applicerat magnetfält i en glaskapillär.
Provbilder som visar MP5 i luftstrupen på en levande sövd råtta.(a) Magneten används för att ta bilder ovanför och till vänster om luftstrupen, sedan (b) efter att ha flyttat magneten till höger.Den röda rutan indikerar förstoringen som förstärker kontrasten.Dessa bilder är från videon som visas i S7s tilläggsvideo: MP5.
När de två polerna var inställda i en nord-sydlig orientering ovanför och under luftstrupen (dvs attraherande; Fig. 3b), verkade MP-ackorden längre och var placerade på luftstrupens sidovägg snarare än på den dorsala ytan av luftstrupen. luftstrupe (se bilaga).Video S9:MP5).Höga koncentrationer av partiklar på ett ställe (dvs. den dorsala ytan av luftstrupen) detekterades dock inte efter vätskeadministrering med en dubbelmagnetanordning, vilket vanligtvis inträffar med en enda magnetanordning.Sedan, när en magnet konfigurerades för att stöta bort motsatta poler (Figur 3c), ökade inte antalet synliga partiklar i synfältet efter leverans.Att ställa in båda magnetkonfigurationerna är utmanande på grund av den höga magnetfältstyrkan som attraherar respektive trycker på magneterna.Inställningen ändrades sedan till en enstaka magnet parallell med luftvägarna men som passerade genom luftvägarna i en 90 graders vinkel så att kraftlinjerna korsade trakealväggen ortogonalt (Figur 3d), en orientering avsedd att bestämma möjligheten för partikelaggregation på sidoväggen.observeras.Men i denna konfiguration fanns det ingen identifierbar MF-ackumuleringsrörelse eller magnetrörelse.Baserat på alla dessa resultat valdes en konfiguration med en enda magnet och en 30-graders orientering för in vivo-studier av genbärare (Fig. 3a).
När djuret avbildades flera gånger omedelbart efter att ha offrats på ett humant sätt, innebar frånvaron av störande vävnadsrörelser att finare, kortare partikellinjer kunde urskiljas i det tydliga interbroskfältet, som "vajande" i enlighet med magnetens translationella rörelse.tydligt se närvaron och rörelsen av MP6-partiklar.
Titern för LV-LacZ var 1,8 x 108 IE/ml, och efter blandning 1:1 med CombiMag MP (MP6) injicerades djuren med 50 µl av en trakeal dos på 9 x 107 IE/ml LV-vehikel (dvs. 4,5 x 106 TU/råtta).).).I dessa studier, istället för att flytta magneten under förlossningen, fixerade vi magneten i ett läge för att avgöra om LV-transduktion kunde (a) förbättras jämfört med vektorleverans i frånvaro av ett magnetfält, och (b) om luftvägen kunde var fokuserad.Cellerna transduceras i de magnetiska målområdena i de övre luftvägarna.
Förekomsten av magneter och användningen av CombiMag i kombination med LV-vektorer verkade inte påverka djurhälsan negativt, vilket gjorde vårt standardprotokoll för LV-vektorleverans.Frontala bilder av trakealregionen utsatt för mekanisk störning (kompletterande fig. 1) visade att den LV-MP-behandlade gruppen hade signifikant högre nivåer av transduktion i närvaro av en magnet (fig. 9a).Endast en liten mängd blå LacZ-färgning fanns i kontrollgruppen (Figur 9b).Kvantifiering av X-Gal-färgade normaliserade regioner visade att administrering av LV-MP i närvaro av ett magnetfält resulterade i en ungefär 6-faldig förbättring (Fig. 9c).
Exempel på sammansatta bilder som visar trakeal transduktion med LV-MP (a) i närvaro av ett magnetfält och (b) i frånvaro av en magnet.(c) Statistiskt signifikant förbättring av det normaliserade området för LacZ-transduktion i luftstrupen med användning av en magnet (*p = 0,029, t-test, n = 3 per grupp, medelvärde ± standardfel för medelvärdet).
Neutrala snabba rödfärgade sektioner (exempel visat i tilläggsfigur 2) indikerade att LacZ-färgade celler var närvarande i samma prov och på samma plats som tidigare rapporterats.
Den viktigaste utmaningen i luftvägsgenterapi är fortfarande den exakta lokaliseringen av bärarpartiklar i områden av intresse och uppnåendet av en hög nivå av transduktionseffektivitet i den mobila lungan i närvaro av luftflöde och aktiv slemrensning.För LV-bärare avsedda för behandling av luftvägssjukdomar vid cystisk fibros har att öka uppehållstiden för bärarpartiklarna i de ledande luftvägarna hittills varit ett ouppnåeligt mål.Som påpekats av Castellani et al., har användningen av magnetfält för att förbättra transduktion fördelar jämfört med andra gentillförselmetoder såsom elektroporering eftersom det kan kombinera enkelhet, ekonomi, lokaliserad leverans, ökad effektivitet och kortare inkubationstid.och möjligen en lägre dos av vehikel10.Emellertid har in vivo avsättning och beteende av magnetiska partiklar i luftvägarna under påverkan av externa magnetiska krafter aldrig beskrivits, och i själva verket har denna metods förmåga att öka genuttrycksnivåerna i intakta levande luftvägar inte visats in vivo.
Våra in vitro-experiment på PCXI-synkrotronen visade att alla partiklar vi testade, med undantag för MP-polystyren, var synliga i bilduppsättningen vi använde.I närvaro av ett magnetfält bildar magnetfält strängar, vars längd är relaterad till typen av partiklar och styrkan på magnetfältet (dvs. magnetens närhet och rörelse).Som visas i figur 10 bildas strängarna vi observerar när varje enskild partikel blir magnetiserad och inducerar sitt eget lokala magnetfält.Dessa separata fält orsakar att andra liknande partiklar samlas och förbinds med gruppsträngrörelser på grund av lokala krafter från de lokala attraktions- och repulsionskrafterna av andra partiklar.
Diagram som visar (a, b) kedjor av partiklar som bildas inuti vätskefyllda kapillärer och (c, d) en luftfylld luftstrupe.Observera att kapillärerna och luftstrupen inte är skalenliga.Panel (a) innehåller också en beskrivning av MF-innehållande Fe3O4-partiklar arrangerade i kedjor.
När magneten rörde sig över kapillären nådde vinkeln på partikelsträngen den kritiska tröskeln för MP3-5 innehållande Fe3O4, varefter partikelsträngen inte längre stannade kvar i sin ursprungliga position, utan flyttade längs ytan till en ny position.magnet.Denna effekt uppstår troligen eftersom ytan på glaskapillären är tillräckligt jämn för att tillåta denna rörelse.Intressant nog betedde sig MP6 (CombiMag) inte på detta sätt, kanske för att partiklarna var mindre, hade en annan beläggning eller ytladdning, eller att den proprietära bärarvätskan påverkade deras förmåga att röra sig.Kontrasten i CombiMag-partikelbilden är också svagare, vilket tyder på att vätskan och partiklarna kan ha samma densitet och därför inte lätt kan röra sig mot varandra.Partiklar kan också fastna om magneten rör sig för snabbt, vilket indikerar att magnetfältets styrka inte alltid kan övervinna friktionen mellan partiklar i vätskan, vilket tyder på att magnetfältets styrka och avståndet mellan magneten och målområdet inte bör komma som en överraskning.Viktig.Dessa resultat indikerar också att även om magneter kan fånga många mikropartiklar som strömmar genom målområdet, är det osannolikt att magneter kan lita på att flytta CombiMag-partiklar längs ytan av luftstrupen.Således drog vi slutsatsen att in vivo LV MF-studier bör använda statiska magnetfält för att fysiskt rikta in sig på specifika områden i luftvägsträdet.
När partiklarna väl har levererats in i kroppen är de svåra att identifiera i samband med kroppens komplexa rörliga vävnad, men deras upptäcktsförmåga har förbättrats genom att magneten flyttas horisontellt över luftstrupen för att "vicka" MP-strängarna.Även om realtidsavbildning är möjlig är det lättare att urskilja partikelrörelser efter att djuret har dödats på mänskligt sätt.MP-koncentrationerna var vanligtvis högst på denna plats när magneten placerades över avbildningsområdet, även om vissa partiklar vanligtvis hittades längre ner i luftstrupen.Till skillnad från in vitro-studier kan partiklar inte dras ner i luftstrupen genom att en magnet rör sig.Detta fynd stämmer överens med hur slemmet som täcker ytan av luftstrupen vanligtvis bearbetar inhalerade partiklar, fångar dem i slemmet och sedan rensar dem genom den muco-ciliära clearance-mekanismen.
Vi antog att användning av magneter ovanför och under luftstrupen för attraktion (Fig. 3b) kunde resultera i ett mer enhetligt magnetfält, snarare än ett magnetfält som är mycket koncentrerat vid en punkt, vilket potentiellt kan resultera i en mer enhetlig fördelning av partiklar..Vår preliminära studie hittade dock inga tydliga bevis för att stödja denna hypotes.På liknande sätt resulterade inte inställningen av ett par magneter för att repulsera (fig. 3c) i att fler partiklar satte sig i bildområdet.Dessa två fynd visar att konfigurationen med dubbla magneter inte signifikant förbättrar den lokala kontrollen av MP-pekning, och att de resulterande starka magnetiska krafterna är svåra att ställa in, vilket gör detta tillvägagångssätt mindre praktiskt.På liknande sätt ökade inte heller orientering av magneten ovanför och över luftstrupen (Figur 3d) antalet partiklar kvar i det avbildade området.Vissa av dessa alternativa konfigurationer kanske inte är framgångsrika eftersom de resulterar i en minskning av magnetfältets styrka i avsättningszonen.Således anses den enkla magnetkonfigurationen vid 30 grader (Fig. 3a) vara den enklaste och mest effektiva in vivo-testmetoden.
LV-MP-studien visade att när LV-vektorer kombinerades med CombiMag och levererades efter att ha blivit fysiskt störda i närvaro av ett magnetfält, ökade transduktionsnivåerna signifikant i luftstrupen jämfört med kontroller.Baserat på synkrotronavbildningsstudier och LacZ-resultat, verkade magnetfältet kunna hålla LV i luftstrupen och minska antalet vektorpartiklar som omedelbart trängde djupt in i lungan.Sådana målinriktningsförbättringar kan leda till högre effektivitet samtidigt som de minskar levererade titrar, icke-riktad transduktion, inflammatoriska och immuna biverkningar och kostnader för genöverföring.Viktigt, enligt tillverkaren, kan CombiMag användas i kombination med andra genöverföringsmetoder, inklusive andra virala vektorer (som AAV) och nukleinsyror.