Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Toxoplasma gondii är en intracellulär protozoparasit som modulerar mikromiljön hos den infekterade värden och är känd för att vara associerad med förekomsten av hjärntumörtillväxt.I denna studie antar vi att exosomal miRNA-21 från Toxoplasma-infektion främjar hjärntumörtillväxt.Exosomer från Toxoplasma-infekterade BV2-mikroglia karakteriserades och internalisering av U87-gliomceller bekräftades.Exosomala mikroRNA-expressionsprofiler analyserades med hjälp av arrayer av mikroRNA och microRNA-21A-5p associerade med Toxoplasma gondii och tumörsortering.Vi undersökte också mRNA-nivåerna av tumörassocierade gener i U87-gliomceller genom att ändra miR-21-nivåer i exosomer och effekten av exosomer på human U87-gliomcellproliferation.I exosomer av U87-gliomceller infekterade med Toxoplasma gondii ökas uttrycket av mikroRNA-21 och aktiviteten hos antitumörgener (FoxO1, PTEN och PDCD4) reduceras.BV2-härledda exosomer infekterade med Toxoplasma inducerar proliferation av U87-gliomceller.Exosomer inducerar tillväxt av U87-celler i en mustumörmodell.Vi föreslår att ökad exosomal miR-21 i Toxoplasma-infekterade BV2-mikroglia kan spela en viktig roll som en celltillväxtpromotor i U87-gliomceller genom att nedreglera antitumörgener.
Det uppskattas att mer än 18,1 miljoner fall av avancerad cancer diagnostiserades över hela världen under 2018, med cirka 297 000 tumörer i centrala nervsystemet diagnostiserade varje år (1,6 % av alla tumörer)1.Tidigare forskning har visat att riskfaktorer för att utveckla mänskliga hjärntumörer inkluderar olika kemiska produkter, familjehistoria och joniserande strålning från huvudterapeutisk och diagnostisk utrustning.Den exakta orsaken till dessa maligniteter är dock okänd.Ungefär 20 % av all cancer i världen orsakas av smittämnen, inklusive virus, bakterier och parasiter3,4.Infektiösa patogener stör värdcellens genetiska mekanismer, såsom DNA-reparation och cellcykeln, och kan leda till kroniska inflammationer och skador på immunförsvaret5.
Smittämnen associerade med human cancer är de vanligaste virala patogenerna, inklusive humana papillomvirus och hepatit B- och C-virus.Parasiter kan också spela en potentiell roll i utvecklingen av cancer hos människor.Flera parasitarter, nämligen Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis och Hymenolepis nana, har varit inblandade i olika typer av cancer hos människor 6,7,8.
Toxoplasma gondii är en intracellulär protozo som reglerar mikromiljön hos infekterade värdceller.Denna parasit beräknas infektera cirka 30 % av världens befolkning, vilket utsätter hela befolkningen för risker9,10.Toxoplasma gondii kan infektera vitala organ, inklusive det centrala nervsystemet (CNS), och orsaka allvarliga sjukdomar som dödlig meningit och hjärninflammation, särskilt hos patienter med nedsatt immunförsvar9.Toxoplasma gondii kan emellertid också förändra miljön för den infekterade värden genom att modulera celltillväxt och immunsvar hos immunkompetenta individer, vilket leder till upprätthållande av en asymtomatisk kronisk infektion9,11.Intressant nog, med tanke på korrelationen mellan T. gondii-prevalens och hjärntumörincidens, tyder vissa rapporter på att in vivo värdmiljöförändringar på grund av kronisk T. gondii-infektion liknar tumörens mikromiljö.
Exosomer är kända som intercellulära kommunikatörer som levererar biologiskt innehåll, inklusive proteiner och nukleinsyror, från närliggande celler16,17.Exosomer kan påverka tumörrelaterade biologiska processer såsom anti-apoptos, angiogenes och metastaser i tumörens mikromiljö.I synnerhet miRNAs (miRNAs), små icke-kodande RNAs cirka 22 nukleotider långa, är viktiga post-transkriptionella genregulatorer som kontrollerar mer än 30% av humant mRNA genom det miRNA-inducerade tystande komplexet (miRISC).Toxoplasma gondii kan störa biologiska processer genom att kontrollera miRNA-uttryck i infekterade värdar.Värd miRNA innehåller viktiga signaler för att reglera värdbiologiska processer för att uppnå parasitens överlevnadsstrategi.Att studera förändringar i värdens miRNA-profil vid infektion med T. gondii kan således hjälpa oss att förstå interaktionen mellan värden och T. gondii tydligare.Thirugnanam et al.15 föreslog att T. gondii främjar hjärncancer genom att ändra dess uttryck på specifika värd-miRNA förknippade med tumörtillväxt och fann att T. gondii kan orsaka gliom hos försöksdjur.
Denna studie fokuserar på förändringen av exosomal miR-21 i värdmikroglia infekterad med Toxoplasma BV2.Vi observerade en möjlig roll för förändrad exosomal miR-21 i tillväxten av U87-gliomceller på grund av retentionen i kärnan av FoxO1/p27, som är målet för överuttryckt miR-21.
Exosomer härledda från BV2 erhölls med hjälp av differentiell centrifugering och validerades med olika metoder för att förhindra kontaminering med cellulära komponenter eller andra vesiklar.SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) visade distinkta mönster mellan proteiner extraherade från BV2-celler och exosomer (Figur 1A), och prover bedömdes för närvaron av Alix, som analyserades genom Western blotting av exosomala proteinmarkörer i .Alix-märkning hittades i exosomproteiner men inte i BV2-cellysatproteiner (Fig. 1B).Dessutom analyserades renat RNA från exosomer härrörande från BV2 med användning av en bioanalysator.18S och 28S ribosomala subenheter observerades sällan i det exosomala RNA-migreringsmönstret, vilket indikerar pålitlig renhet (Figur 1C).Slutligen visade transmissionselektronmikroskopi att de observerade exosomerna var cirka 60–150 nm stora och hade en koppliknande struktur typisk för exosommorfologi (Fig. 1D).
Karakterisering av exosomer härledda från BV2-celler.(A) Sida med säkerhetsdatablad.Proteiner isolerades från BV2-celler eller exosomer härledda från BV2.Proteinmönster skiljer sig mellan celler och exosomer.(B) Western blot-analys av en exosomal markör (Alix).(C) Utvärdering av renat RNA från BV2-celler och BV2-härledda exosomer med användning av en bioanalysator.Således hittades 18S och 28S ribosomala subenheter i BV2-celler sällan i exosomal RNA.(D) Transmissionselektronmikroskopi visade att exosomer isolerade från BV2-celler var negativt färgade med 2% uranylacetat.Exosomer är cirka 60-150 nm stora och skålformade (Song och Jung, opublicerade data).
Cellulär internalisering av BV2-härledda exosomer i U87 humana gliomceller observerades med användning av konfokalmikroskopi.PKH26-märkta exosomer är lokaliserade i cytoplasman hos U87-celler.Kärnor färgades med DAPI (Fig. 2A), vilket indikerar att BV2-härledda exosomer kan internaliseras av värdceller och påverka miljön hos mottagarceller.
Internalisering av BV2-härledda exosomer till U87-gliomceller och BV2-härledda exosomer infekterade med Toxoplasma RH inducerade proliferation av U87-gliomceller.(A) Exosomer uppslukade av U87-celler mätt med konfokalmikroskopi.U87-gliomceller inkuberades med exosomer märkta med PKH26 (röd) eller utan kontroll under 24 timmar.Kärnorna färgades med DAPI (blå) och observerades sedan under ett konfokalmikroskop (skala bar: 10 μm, x 3000).(B) U87-gliomcellproliferation bestämdes genom cellproliferationsanalys.U87-gliomceller behandlades med exosomer under den angivna tiden. *P < 0,05 erhölls med Students t-test. *P < 0,05 erhölls med Students t-test. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 enligt Students t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 erhållet med Students t-test.
Efter att ha bekräftat internaliseringen av BV2-härledda exosomer i U87-gliomceller utförde vi cellproliferationsanalyser för att undersöka rollen av BV2-härledda Toxoplasma-härledda exosomer i utvecklingen av humana gliomceller.Behandling av U87-celler med exosomer från T. gondii-infekterade BV2-celler visade att T. gondii-infekterade BV2-härledda exosomer orsakade signifikant högre proliferation av U87-celler jämfört med kontroll (Fig. 2B).
Dessutom hade tillväxt av U118-celler samma resultat som U87, eftersom Toxoplasmastimulerade exosomer orsakade de högsta nivåerna av proliferation (data visas inte).Baserat på dessa data kan vi indikera att BV2-härledda Toxoplasma-infekterade exosomer spelar en viktig roll i gliomcellsproliferation.
För att undersöka effekten av Toxoplasma-infekterade BV2-härledda exosomer på tumörutveckling, injicerade vi U87-gliomceller i nakna möss för en xenograftmodell och injicerade BV2-härledda exosomer eller RH-infekterade BV2-härledda exosomer.Efter att tumörer blev uppenbara efter 1 vecka, delades varje experimentgrupp om 5 möss upp efter tumörstorlek för att bestämma samma utgångspunkt, och tumörstorleken mättes under 22 dagar.
Hos möss med U87-xenograftmodellen observerades signifikant större tumörstorlek och vikt i den BV2-härledda RH-infekterade exosomgruppen vid dag 22 (Fig. 3A,B).Å andra sidan fanns det ingen signifikant skillnad i tumörstorlek mellan den BV2-härledda exosomgruppen och kontrollgruppen efter exosombehandling.Dessutom visade möss injicerade med gliomceller och exosomer visuellt den största tumörvolymen i gruppen av RH-infekterade BV2-härledda exosomer (Fig. 3C).Dessa resultat visar att BV2-härledda Toxoplasma-infekterade exosomer inducerar gliomtillväxt i en mustumörmodell.
Onkogenes (AC) av BV2-härledda exosomer i en U87 xenograft-musmodell.Tumörstorlek (A) och vikt (B) ökade signifikant i BALB/c nakna möss behandlade med RH-infekterade exosomer härledda från BV2.BALB/c nakna möss (C) injicerades subkutant med 1 x 107 U87-celler suspenderade i Matrigel-blandning.Sex dagar efter injektionen behandlades 100 μg BV2-härledda exosomer i möss.Tumörstorlek och vikt mättes på de angivna dagarna respektive efter avlivning. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Data visade att 37 miRNA (16 överuttryckta och 21 neduttryckta) associerade med immunitet eller tumörutveckling förändrades signifikant i mikroglia efter infektion med Toxoplasma RH-stammen (Fig. 4A).Relativa uttrycksnivåer av miR-21 bland förändrade miRNA bekräftades av realtids-RT-PCR i exosomer härledda från BV2, exosomer behandlade med BV2- och U87-celler.Uttryck av miR-21 visade en signifikant ökning av exosomer från BV2-celler infekterade med Toxoplasma gondii (RH-stam) (Fig. 4B).Relativa uttrycksnivåer av miR-21 i BV2- och U87-celler ökade efter upptag av förändrade exosomer (Fig. 4B).De relativa nivåerna av miR-21-uttryck i hjärnvävnaderna hos tumörpatienter och möss infekterade med Toxoplasma gondii (ME49-stam) var högre än i kontroller, respektive (Fig. 4C).Dessa resultat korrelerar med skillnader mellan uttrycksnivåerna för förutsagda och bekräftade mikroRNA in vitro och in vivo.
Förändringar i uttrycket av exosomal miP-21a-5p i mikroglia infekterade med Toxoplasma gondii (RH).(A) Visar betydande förändringar i siRNA associerade med immunitet eller tumörutveckling efter T. gondii RH-infektion.(B) Relativa miR-21-uttrycksnivåer upptäcktes genom realtids-RT-PCR i BV2-härledda exosomer, BV2-behandlade exosomer och U87-celler.(C) Relativa miR-21 uttrycksnivåer hittades i hjärnvävnaden hos tumörpatienter (N=3) och möss infekterade med Toxoplasma gondii (ME49-stam) (N=3). *P < 0,05 erhölls med Students t-test. *P < 0,05 erhölls med Students t-test. *P < 0,05 för att få tillgång till t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 erhölls med Students t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 erhållet med Students t-test.
Exosomer från RH-infekterade BV2-celler ledde till tillväxten av gliom in vivo och in vitro (Fig. 2, 3).För att upptäcka relevanta mRNA, undersökte vi mRNA-nivåer av antitumörmålgener, gaffelbox O1 (FoxO1), PTEN och programmerad celldöd 4 (PDCD4) i U87-celler infekterade med exosomer härledda från BV2 eller RH BV2.Bioinformatikanalys har visat att flera tumörassocierade gener, inklusive FoxO1-, PTEN- och PDCD4-gener, har miR-2121,22-bindningsställen.mRNA-nivåer av antitumörmålgener reducerades i RH-infekterade BV2-härledda exosomer jämfört med BV2-härledda exosomer (Fig. 5A).FoxO1 visade minskade proteinnivåer i RH-infekterade BV2-härledda exosomer jämfört med BV2-härledda exosomer (Figur 5B).Baserat på dessa resultat kunde vi bekräfta att exosomer härledda från RH-infekterade BV2 nedreglerar anti-onkogena gener och bibehåller sin roll i tumörtillväxt.
Toxoplasma RH-infekterade BV2-härledda exosomer inducerar suppression av antitumörgener i U87-gliomceller av Toxoplasma RH-infekterade BV2-härledda exosomer.(A) Realtids-PCR av FoxO1-, PTEN- och PDCD4-uttryck i exosomer härledda från T. gondii RH-infekterad BV2 jämfört med PBS-exosomer.p-aktin-mRNA användes som kontroll.(B) FoxO1-uttryck bestämdes genom Western blotting och densitometridata utvärderades statistiskt med hjälp av ImageJ-programmet. *P < 0,05 erhölls med Students t-test. *P < 0,05 erhölls med Students t-test. *P < 0,05 för att få tillgång till t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 erhölls med Students t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 erhållet med Students t-test.
För att förstå effekten av miP-21 i exosomer på tumörassocierad genreglering, transfekterades U87-celler med en hämmare av miP-21 med användning av Lipofectamine 2000 och cellerna skördades 24 timmar efter transfektion.FoxO1 och p27 uttrycksnivåer i celler transfekterade med miR-21-hämmare jämfördes med celler behandlade med BV2-härledda exosomer med användning av QRT-PCR (Fig. 6A, B).Transfektion av miR-21-hämmaren in i U87-celler nedreglerade signifikant FoxO1- och p27-uttrycket (FIG. 6).
RH-infekterad exosomal BV2-härledd miP-21 förändrade FoxO1/p27-uttrycket i U87-gliomceller.U87-celler transfekterades med miP-21-hämmare med användning av Lipofectamine 2000 och celler skördades 24 timmar efter transfektion.FoxO1- och p27-expressionsnivåer i celler transfekterade med miR-21-hämmare jämfördes med nivåer i celler behandlade med BV2-härledda exosomer med användning av QRT-PCR (A, B).
För att undkomma värdens immunsvar förvandlas Toxoplasma-parasiten till en vävnadscysta.De parasiterar olika vävnader, inklusive hjärnan, hjärtat och skelettmuskeln, under hela värdens livstid och modulerar värdens immunsvar.Dessutom kan de reglera cellcykeln och apoptos hos värdceller, vilket främjar deras proliferation14,24.Toxoplasma gondii infekterar huvudsakligen värddendritiska celler, neutrofiler och monocyt-/makrofagerstamning, inklusive hjärnmikroglia.Toxoplasma gondii inducerar differentieringen av makrofager av M2-fenotypen, påverkar sårläkning efter patogeninfektion och är också associerad med hypervaskularisering och granulomatös fibros.Denna beteendepatogenes av Toxoplasmainfektion kan vara relaterad till markörer associerade med tumörutveckling.Den fientliga miljön som regleras av Toxoplasma kan likna motsvarande precancer.Därför kan det antas att Toxoplasmainfektion bör bidra till utvecklingen av hjärntumörer.Faktum är att höga frekvenser av Toxoplasma-infektion har rapporterats i serum hos patienter med olika hjärntumörer.Dessutom kan Toxoplasma gondii vara en annan cancerframkallande effektor och verka synergistiskt för att hjälpa andra infektiösa cancerframkallande ämnen att utveckla hjärntumörer.I detta avseende är det värt att notera att P. falciparum och Epstein-Barr-virus synergistiskt bidrar till bildandet av Burkitts lymfom.
Exosomes roll som regulatorer inom cancerforskningen har undersökts omfattande.Emellertid är exosomes roll mellan parasiter och infekterade värdar fortfarande dåligt förstådd.Hittills har olika regulatorer, inklusive utsöndrade proteiner, förklarat de biologiska processer genom vilka protozoparasiter motstår värdattack och vidmakthåller infektion.Nyligen har det funnits ett växande koncept att protozoassocierade mikrovesiklar och deras mikroRNA interagerar med värdceller för att skapa en gynnsam miljö för deras överlevnad.Därför behövs ytterligare studier för att upptäcka sambandet mellan förändrade exosomala miRNA och gliomcellsproliferation.MikroRNA-förändring (klustergener miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 och miR-17-92) binder till STAT3-promotorn i toxoplasma-infekterade humana makrofager, regleras och inducerar anti -apoptos som svar på Toxoplasma gondii-infektion 29 .Toxoplasmainfektion ökar uttrycket av miR-17-5p och miR-106b-5p, som är associerade med flera hyperproliferativa sjukdomar 30 .Dessa data tyder på att värd-miRNA som regleras av Toxoplasma-infektion är viktiga molekyler för parasitöverlevnad och patogenes i värdens biologiska beteende.
Förändrade miRNA kan påverka olika typer av beteende under initiering och progression av maligna celler, inklusive gliom: självförsörjning av tillväxtsignaler, okänslighet för tillväxthämmande signaler, apoptosflykt, obegränsad replikativ potential, angiogenes, invasion och metastaser och inflammation.I gliom har förändrade miRNA identifierats i flera expressionsprofileringsstudier.
I den aktuella studien bekräftade vi höga nivåer av miRNA-21-uttryck i toxoplasmainfekterade värdceller.miR-21 har identifierats som en av de mest frekvent överuttryckta mikroRNA i solida tumörer, inklusive gliom, 33 och dess uttryck korrelerar med graden av gliom.Ackumulerande bevis tyder på att miR-21 är en ny onkogen som fungerar som en anti-apoptotisk faktor i gliomtillväxt och är starkt överuttryckt i vävnader och plasma av maligniteter i mänsklig hjärna.Intressant nog utlöser miR-21-inaktivering i gliomceller och vävnader hämningen av cellproliferation på grund av kaspasberoende apoptos.Bioinformatisk analys av miR-21 förutspådde mål avslöjade flera tumörsuppressorgener associerade med apoptosvägar, inklusive programmerad celldöd 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN och gaffellåda O1 (FoxO1), med miR-2121-bindningsstället..22.38.
FoxO1, som en av transkriptionsfaktorerna (FoxO), är involverad i utvecklingen av olika typer av human cancer och kan reglera uttrycket av tumörsuppressorgener som p21, p27, Bim och FasL40.FoxO1 kan binda och aktivera cellcykelhämmare som p27 för att undertrycka celltillväxt.Dessutom är FoxO1 en nyckeleffektor för PI3K/Akt-signalering och reglerar många biologiska processer som cellcykelprogression och celldifferentiering genom aktivering av p2742-transkription.
Sammanfattningsvis tror vi att exosomal miR-21 härrörande från Toxoplasma-infekterade mikroglia kan spela en viktig roll som tillväxtregulator av gliomceller (Fig. 7).Ytterligare studier behövs dock för att hitta ett direkt samband mellan exosomal miR-21, förändrad Toxoplasmainfektion och gliomtillväxt.Dessa resultat förväntas ge en utgångspunkt för att studera sambandet mellan Toxoplasmainfektion och förekomsten av gliom.
Ett schematiskt diagram av mekanismen för gliom (hjärna) karcinogenes föreslås i denna studie.Författaren ritar i PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Alla experimentella protokoll i denna studie, inklusive användningen av djur, var i enlighet med Seoul National University Animal Care and User Committee Standard Ethical Guidelines och godkändes av Institutional Review Board vid Seoul National University School of Medicine (IRB-nummer SNU- 150715).-2).Alla experimentella procedurer utfördes i enlighet med ARRIVEs rekommendationer.
BV2 mus-mikroglia och U87 humana gliomceller odlades i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) respektive Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), vardera innehållande 10% fetalt bovint serum, 4 mM l- glutamin, 0,2 mM penicillin och 0,05 mM streptomycin.Celler odlades i en inkubator med 5% CO2 vid 37°C.En annan gliomcellinje, U118, användes för jämförelse med U87-celler.
För att isolera exosomer från T. gondii-infekterade RH- och ME49-stammar, skördades T. gondii-tachyzoiter (RH-stam) från bukhålan hos 6 veckor gamla BALB/c-möss injicerade 3-4 dagar tidigare.Takyzoiter tvättades tre gånger med PBS och renades genom centrifugering i 40 % Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.För att erhålla tachyzoiter av stam ME49 injicerades BALB/c-möss intraperitonealt med 20 vävnadscystor och tachyzoittransformation i cystor samlades upp genom att tvätta bukhålan den 6-8:e dagen efter infektion (PI).Möss infekterade med PBS.ME49 tachyzoiter odlades i celler kompletterade med 100 μg/ml penicillin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomycin (Gibco/BRL) och 5% fetalt bovint serum (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) vid 37 °C och 5 % koldioxid.Efter odling i Vero-celler fördes ME49-tachyzoiter två gånger genom en 25 gauge nål och sedan genom ett 5 µm filter för att avlägsna skräp och celler.Efter tvättning återsuspenderades tachyzoiterna i PBS44.Vävnadscystor av Toxoplasma gondii stam ME49 upprätthölls genom intraperitoneal injektion av cystor isolerade från hjärnan hos infekterade C57BL/6-möss (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Hjärnan hos ME49-infekterade möss skördades efter 3 månaders PI och maldes under ett mikroskop för att isolera cystor.De infekterade mössen hölls under speciella patogenfria förhållanden (SPF) vid Seoul National University School of Medicine.
Totalt RNA extraherades från BV2-härledda exosomer, BV2-celler och vävnader med hjälp av miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner, inklusive inkubationstiden för elueringssteget.RNA-koncentrationen bestämdes på en NanoDrop 2000 spektrofotometer.Kvaliteten på RNA-mikroarrayer utvärderades med en Agilent 2100 bioanalysator (Agilent Technologies, Amstelveen, Nederländerna).
DMEM med 10 % exosomfattig FBS framställdes genom ultracentrifugering vid 100 000 g under 16 timmar vid 4°C och filtrerades genom ett 0,22 µm filter (Nalgene, Rochester, NY, USA).BV2-celler, 5 × 105, odlades i DMEM innehållande 10 % exosomutarmat FBS och 1 % antibiotika vid 37°C och 5 % CO2.Efter 24 timmars inkubation tillsattes tachyzoiter av stam RH eller ME49 (MOI = 10) till cellerna och icke-invaderande parasiter avlägsnades inom en timme och återfylldes med DMEM.Exosomer från BV2-celler isolerades genom modifierad differentialcentrifugering, den mest använda metoden.Resuspendera exosompelleten i 300 µl PBS för RNA- eller proteinanalys.Koncentrationen av isolerade exosomer bestämdes med användning av ett BCA-proteinanalyskit (Pierce, Rockford, IL, USA) och en NanoDrop 2000 spektrofotometer.
Fällningar från BV2-celler eller exosomer härledda från BV2 lyserades i PRO-PREP™-proteinextraktionslösning (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) och proteiner laddades på Coomassie brilliant blue-färgade 10% SDS-polyakrylamidgeler.Dessutom överfördes proteiner till PVDF-membran under 2 timmar.Western blöts validerades med användning av Alix-antikroppen (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) som en exosomal markör.HRP-konjugerad get-anti-mus IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) och en LAS-1000 plus luminescerande bildanalysator (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) användes som en sekundär antikropp..Transmissionselektronmikroskopi utfördes för att studera storleken och morfologin hos exosomer.Exosomer isolerade från BV2-celler (6,40 µg/µl) preparerades på kolbelagda nät och färgades negativt med 2 % uranylacetat under 1 min.De preparerade proverna observerades vid en accelererande spänning på 80 kV med användning av en JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japan) utrustad med en ES1000W Erlangshen CCD-kamera (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
BV2-härledda exosomer färgades med användning av PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) under 15 minuter vid rumstemperatur.U87-celler, 2×105, med PKH26-märkta exosomer (röda) eller inga exosomer som negativ kontroll, inkuberades vid 37°C under 24 timmar i en 5% CO2-inkubator.U87-cellkärnor färgades med DAPI (blå), U87-celler fixerades i 4% paraformaldehyd under 15 minuter vid 4°C och analyserades sedan i ett Leica TCS SP8 STED CW konfokalmikroskopsystem (Leica Microsystems, Mannheim, Tyskland).märkbar.
cDNA syntetiserades från siRNA med användning av Mir-X siRNA första strängsyntes och SYBR qRT-PCR kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Kvantitativ PCR i realtid utfördes med iQ5 realtids-PCR-detektionssystem (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) med användning av primers och mallar blandade med SYBR Premix.DNA amplifierades under 40 cykler av denaturering vid 95°C under 15 s och hybridisering vid 60°C under 60 s.Data från varje PCR-reaktion analyserades med hjälp av dataanalysmodulen för iQ™5 optiska systemmjukvaran (Bio-Rad).Relativa förändringar i genuttryck mellan utvalda målgener och β-aktin/siRNA (och U6) beräknades med hjälp av standardkurvmetoden.De använda primersekvenserna visas i tabell 1.
3 x 104 U87-gliomceller såddes i plattor med 96 brunnar och blandades med Toxoplasma-infekterade exosomer härledda från BV2 (50 μg/mL) eller icke-pulsexosomer härledda från BV2 (50 μg/ml) som kontroller vid 12, 18 och 36 timmar .Cellproliferationshastigheten bestämdes med användning av Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (kompletterande figurer S1-S3) 46 .
5 veckor gamla BALB/c nakna möss av honkön köptes från Orient Bio (Seongnam-si, Sydkorea) och hölls individuellt i sterila burar vid rumstemperatur (22±2°C) och fuktighet (45±15°C).%) vid rumstemperatur (22±2°C) och luftfuktighet (45±15%).En 12-timmars ljuscykel och en 12-timmars mörkcykel utfördes under SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Möss delades slumpmässigt in i tre grupper om 5 möss vardera och alla grupper injicerades subkutant med 400 ml PBS innehållande 1 x 107 U87 gliomceller och tillväxtfaktorreducerad BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Sex dagar efter tumörinjektion injicerades 200 mg exosomer härledda från BV2-celler (med/utan Toxoplasma-infektion) på tumörstället.Tjugotvå dagar efter tumörinfektion mättes tumörstorleken hos möss i varje grupp med en skjutmått tre gånger i veckan, och tumörvolymen beräknades med formeln: 0,5 × (bredd) × 2 × längd.
MikroRNA-expressionsanalys med hjälp av miRCURYTM LNA miRNA-array, 7:e generationen har mmu- och rno-matriser (EXIQON, Vedbaek, Danmark) som täcker 1119 välkarakteriserade möss bland 3100 human-, mus- och rått-miRNA-fångningssonder.Under denna procedur avlägsnades 250 till 1000 ng totalt RNA från 5'-fosfatet genom behandling med alkaliskt fosfatas från kalvtarm följt av märkning med Hy3 grönt fluorescerande färgämne.De märkta proverna hybridiserades sedan genom att ladda mikroarray-objektglas med användning av ett hybridiseringskammarkit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) och ett hybridiseringsobjektglaskit (Agilent Technologies).Hybridisering utfördes under 16 timmar vid 56°C, därefter tvättades mikroarrayerna i enlighet med tillverkarens rekommendationer.De bearbetade mikroarray-objektglasen skannades sedan med hjälp av ett Agilent G2565CA mikroarray-skannersystem (Agilent Technologies).Skannade bilder importerades med programvaran Agilent Feature Extraction version 10.7.3.1 (Agilent Technologies) och fluorescensintensiteten för varje bild kvantifierades med hjälp av motsvarande GAL-fil i det modifierade Exiqon-protokollet.Mikroarraydata för den aktuella studien deponeras i GEO-databasen under åtkomstnummer GPL32397.
Uttrycksprofiler av mogna exosomala miRNA i mikroglia av RH- eller ME49-stammar infekterade med Toxoplasma analyserades med hjälp av olika nätverksverktyg.miRNA associerade med tumörutveckling identifierades med hjälp av miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) och filtrerades bort med normaliserad signalintensitet (log2) större än 8,0.Bland miRNA visade sig differentiellt uttryckta miRNA vara mer än 1,5 gånger förändrade genom filteranalys av miRNA förändrade av RH- eller ME49-stammar infekterade med T. gondii.
Celler såddes i plattor med sex brunnar (3 x 105 celler/brunn) i opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).De transfekterade cellerna odlades under 6 timmar och sedan byttes mediet till färskt komplett medium.Celler skördades 24 timmar efter transfektion.
Statistisk analys utfördes huvudsakligen med Students t-test med Excel-mjukvara (Microsoft, Washington, DC, USA).För experimentell djuranalys utfördes en tvåvägs ANOVA med Prism 3.0-programvara (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-värden < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta. P-värden < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-värden <0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-värden <0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta.
Alla experimentella protokoll som användes i denna studie godkändes av Institutional Review Board vid Seoul National University School of Medicine (IRB-nummer SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Beräknad global cancerincidens och dödlighet 2018: GLOBOCAN källor och metoder.Tolkning.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS En inblick i riskfaktorerna för hjärntumörer och deras terapeutiska ingrepp. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS En inblick i riskfaktorerna för hjärntumörer och deras terapeutiska ingrepp.Rashid, S., Rehman, K. och Akash, MS En genomgång av riskfaktorer för hjärntumörer och större terapeutiska ingrepp. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Djup förståelse för hjärntumörriskfaktorer och terapeutiska ingrepp.Rashid, S., Rehman, K. och Akash, MS En genomgång av riskfaktorer för hjärntumörer och större terapeutiska ingrepp.Biomedicinsk vetenskap.Apotekare.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriell-virala interaktioner i humana orodigestive och kvinnliga genitala cancer: En sammanfattning av epidemiologiska och laboratoriebevis. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriell-virala interaktioner i humana orodigestive och kvinnliga genitala cancer: En sammanfattning av epidemiologiska och laboratoriebevis.Kato I., Zhang J. och Sun J. Bakteriell-virala interaktioner i cancer i det mänskliga mag-tarmkanalen och kvinnliga könsorganen: en sammanfattning av epidemiologiska och laboratoriedata. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.据总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-viral interaktion i matsmältning i mänsklig munhåla och kvinnlig reproduktionskanal: sammanfattning av populär sjukdomsvetenskap och laboratoriebevis.Kato I., Zhang J. och Sun J. Bakteriell-virala interaktioner i human gastrointestinal cancer och kvinnlig genital cancer: en sammanfattning av epidemiologiska och laboratoriedata.Cancer 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Från infektion till cancer: Hur DNA-tumörvirus förändrar värdcellens centrala kol- och lipidmetabolism. Magon, KL & Parish, JL Från infektion till cancer: Hur DNA-tumörvirus förändrar värdcellens centrala kol- och lipidmetabolism.Mahon, KL och Parish, JL Brandinfektion till cancer: hur DNA-baserade tumörvirus förändrar värdcellens centrala kol- och lipidmetabolism. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢 Magon, KL & Parish, JL Från infektion till cancer: hur DNA-tumörvirus förändrar värdcellens centrala kol- och lipidmetabolism.Mahon, KL och Parish, JL Bränder infektion till cancer: hur DNA-tumörvirus förändrar central kol- och lipidmetabolism i värdceller.Öppen biologi.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Katekolöstrogener från schistosomer och leverflingor och helmintassocierad cancer.främre.varmt inuti.5, 444 (2014).